JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:52 dk • July 8th, 2025
Sıçan embriyosu hipokampisini ele alalım.
Tripsin ekleyin. Hipokampal hücreleri gevşeterek doku matrisinin bozulmasına aracılık etmek için kuluçkaya yatırın.
Bir tampon ile seyreltin. Tripsin ile sürekli enzimatik sindirim için kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, doku kütlesini ortam içeren bir tüpe aktarın. Tek hücrelere mekanik ayrışma için tekrar tekrar pipetleyin.
Kültür plakaları içindeki poli-L-lizin kaplı lameller üzerindeki tohum hücreleri.
Kuluçkaya yatmak. Hipokampal hücreler kaplanmış yüzeylere yapışır. Nöronlar bir lamel geliştirir ve küçük nöritleri uzatır.
Ayrıca, nöritler aksonal ve dendritik süreçlerle büyür ve bir nöronal ağ oluşturur.
Olgun nöronlar sinaptik uyarıcı reseptörleri, N-Metil-D-aspartat reseptörlerini veya NMDAR'ları eksprese eder.
İnkübasyon sonrası, lamelleri medya ile yıkayın.
Seyreltilmiş bir otoimmün ensefalit hasta serumu ekleyin. Otoantikorlar nöronal NMDAR'lara bağlanır.
Tampon ile yıkayın ve ardından hücreleri sabitleyin.
NMDAR'a bağlı otoantikorlara bağlanan florofor işaretli ikincil antikorlar ekleyin.
Tampon ile yıkayınız. Çekirdekleri lekelemek için lamel DAPI içeren montaj ortamının üzerine yerleştirin.
Nöronlar üzerindeki floresan sinyallerini mikroskobik olarak gözlemleyin, bu da serumda otoantikorların varlığını gösterir.
Hipokampus içeren 50 mililitrelik tüpte 1 mililitre% 2.5 tripsin de hipokampusun enzimatik ayrışması için, tüpteki hacmi HBSS ile 5 mililitreye getirdikten sonra, tüpü 37 santigrat derecede su banyosunda 15 dakika inkübe edin. Tripsini daha da seyreltmek için, 10 mililitre önceden ısıtılmış HBSS ekleyin ve tüpü 5 dakika boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış su banyosuna geri yerleştirin.
Daha sonra, mukoza kütlesi olarak görünen hipokampusları 50 mililitrelik bir tüpe aktarmak için 1.000 mikrolitrelik bir mikropipet kullanın ve dokuyu gösterildiği gibi 5 dakika boyunca 6 mililitre önceden ısıtılmış HBSS ile inkübe edin. Dokuyu mekanik olarak ayırmak için, hipokampal kütleyi konik tabanlı 2 mililitrelik bir tüpe aktarın. 1 mililitre önceden ısıtılmış DMEM ortamı ekledikten sonra, peleti 1.000 mikrolitrelik bir mikropipet ile hafifçe yukarı ve aşağı aspire ederek homojenize edin.
Kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek, karışım yarı saydam olana kadar ucu tüpün konik tabanı ile temas edecek şekilde önceden çekilmiş bir cam pipetle yukarı ve aşağı aspirasyonu 10 ila 20 kez tekrarlayın. Hücreleri, çapraz sallama hareketleriyle 3,5 santimetrelik bir tabağa eşit olarak dağıtmadan önce sayın. Bittiğinde, çanağı% 5 karbondioksit içeren inkübatöre yerleştirin.
14 günlük in-vitro hücrelerin floresan immün boyaması için, anti-NMDAR antikorları içeren numuneyi lamellere ekleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Bir saat sonra, numuneyi PBS içinde% 4 formaldehit ile bir fiksasyon çözeltisi olarak, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca muamele edin. Daha sonra numuneyi her biri 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın, ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1 ila 1.000 seyreltmede ikincil antikor keçi anti-insan Alexa Fluor 488 ilavesi ile yıkayın. Ardından, numuneyi içeren lamelleri bir sıvı montaj ortamı ile monte edin ve kalan sıvıyı aspire edin.