Respiratuar Sinsityal Virüse Özgü Nötralize Edici Antikor Titresini Ölçmek İçin Bir Test

Solunum sinsityal virüsü veya RSV'ye özgü nötralize edici antikorlar içeren seri olarak seyreltilmiş, ısıyla etkisiz hale getirilmiş insan serumu alın.

Viral süspansiyonu ekleyin. Antikorlar, virüsleri seyreltmeye bağlı bir şekilde nötralize eder.

Karışımı insan epitel hücresi tek katmanlarına verin ve viral adsorpsiyon için inkübe edin.

Karışımı atın. Yarı katı bir kaplama oluşturan karboksimetilselüloz içeren ortamı ekleyin. Kuluçkaya yatmak.

RSV, viral RNA ve proteinleri sentezlemek için konakçı hücre makinesini kullanır ve bunlar daha sonra ayrı viryonlar olarak bir araya gelir ve tomurcuklanır.

Enfekte hücreler sonunda ölür. Karboksimetilselüloz virüs hareketini kısıtlayarak lokalize enfeksiyona ve hücre ölümüne neden olarak plaklar oluşturur.

Kaplamayı çıkarın.

Hücreleri aseton içeren bir tamponla sabitleyin. Hücrelere nüfuz etmek ve spesifik olmayan antikor etkileşimlerini önlemek için deterjan içeren bir bloke edici tampon ekleyin.

Viral proteinleri hedef alan birincil antikorlar ekleyin.

Primer antikorları hedef alan florofor konjuge sekonjene sekonder antikorlarla kaplama.

Floresan plakların miktarını belirlemek için kuyuları görüntüleyin.

RSV'nin yüzde ellisini nötralize eden en yüksek serum seyreltmesi, nötralizasyon titresini temsil eder.

A549 hücrelerinin RSV ile aşılanmasından önce, A549 hücre tek katmanlarının% 80 birleşik olduğunu doğrulamak için hücre plakasını bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Ardından, ortamı atmak için plakayı nazikçe ters çevirin ve plakayı steril, emici bir kağıt havlu üzerinde hafifçe kurulayın. Her yıkamadan sonra filtrelenmiş, steril PBS ile.

Daha sonra, el yazmasında sağlanan plaka şablonuna göre A549 hücre plakası üzerindeki ilgili kuyucuklara virüs-serum karışımının oyuklu başına 100 mikrolitre ekleyin ve plakayı bir saat boyunca% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, oyuk başına 90 mikrolitre çıkarmak için bir pipet kullanın ve 1X M 199,% 1.5 CMC ve% 2 FCS ve penisilin-streptomisin karışımı içeren 100 mikrolitre ortam ekleyin. Plakayı üç gün boyunca% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bir tahlil plakasını sabitlemek ve geliştirmek için, önce RSV ile enfekte olmuş A549 hücre plakasını M 199, CMC,% 2 FCS ve penisilin-streptomisin karışımı içeren ortamı atmak için hafifçe ters çevirin. Ardından, her bir kuyucuğa yavaşça 200 mikrolitre sabitleme tamponu ekleyin. Plakayı eksi 20 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Ardından, sabitleme tamponunu atın ve emici bir kağıt havlu üzerine hafifçe kurulayın.

Plakayı yüzü aşağı bakacak şekilde 10 dakika kurumaya bırakın. Daha sonra, 0.05 polisorbat-20 içeren filtrelenmiş PBS tamponu ile% 5 süt bloke edici çözelti yapın. Her oyuğa 200 mikrolitre blokaj çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, çözeltiyi atmak için plakayı hafifçe ters çevirin ve emici bir kağıt havlu üzerine kurulayın.

Birincil antikoru yapmak için, bloke edici çözeltide 1 ila 500 Goat X RSV antikorunu seyreltin. Her oyuğa 50 mikrolitre ekleyin ve plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Plakayı filtrelenmiş PBS polisorbat ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, bloke edici çözelti içinde 1 ila 5.000 AlexaFluor Donkey anti-Goat immünoglobulin G seyrelterek ikincil antikoru yapın. Her oyuğa 50 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Plakayı filtrelenmiş PBS polisorbat ile beş kez yıkayın.

Otomatik bir nokta okuyucu ile plakları saymak için, önce FITC kanalına sayım ayarlarını girerek cihazı kalibre etmek için kullanılmayan bir 96 oyuklu kültür plakası kullanın. Ardından hücre plakasını okuyun, folyoya sarın ve 4 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, artefakt plaklar veya bozulmuş hücre tek katmanları için kuyucukların görüntülerini kontrol edin ve bozulmuş hücre tek katmanları olan kuyuları hariç tutun.