Elektrokemilüminesans Testi Kullanılarak İnsan Adacığı Otoantikorlarının Tespiti

Tip 1 diyabetin bir biyobelirteci olan adacık otoantikorlarını tespit etmek için insan serum örneklerini alın ve enterferans yapan bileşenleri inhibe etmek için asetik asit ekleyin.

İnkübe edin ve ardından asidi nötralize etmek için bir alkali tampon ekleyin.

Tedavi edilen serumu, her biri test için optimal bir konsantrasyonda olan biyotinile yakalama ve rutenyum konjuge antijenleri dahil olmak üzere insan adacık otoantijenlerinin bir karışımını içeren çok kuyulu bir plakaya aktarın.

Pozitif numunedeki adacık otoantikoru, rutenyum konjuge antijeni biyotinile yakalama antijenine köprü kurarak bir antijen-antikor kompleksi oluşturur.

Karışımı, bir bloke edici madde ile önceden işlenmiş ve çalışma ve karşı elektrotlarla donatılmış, streptavidin kaplı bir elektrokemilüminesans plakasına aktarın.

Bağlı streptavidin ile biyotinile kompleks etkileşimlere izin vermek için inkübe edin ve ardından yıkayın.

Tripropilamin veya TPA içeren bir tampon ekleyin.

Bir elektrokemilüminesans cihazında, elektrotlar arasındaki voltaj uygulaması, rutenyum ve TPA'nın oksidasyonunu başlatarak TPA radikalleri üretir.

TPA radikalleri, temel durumlarına geri dönerken fotonlar yayan rutenyum komplekslerini uyarır.

Pozitif numunede yüksek bir kemilüminesans, adacık otoantikorlarının varlığını gösterir.

İnsan adacık otoantijenini bir tüpte 1: 5 molar oranında biotin veya sülfo-etiket ile karıştırın ve her iki etiket de ışığa duyarlı olduğundan tüpü alüminyum folyo ile kaplayın. Ardından, tüpü oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bu arada, inkübasyon devam ederken, spin kolonunu iki kat fosfat tamponlu tuzlu su ile astarlayın.

Ardından, sütunu her seferinde iki dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, otoantijen etiket karışımını spin kolonunda 2 dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, bu etiketli antijeni alikot edin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Daha sonra, 96 oyuklu plaka başına 3 mililitre antijen çözeltisi hazırlamak için antijen tamponu için dama tahtası tahliline dayalı olarak biotin sülfo-etiket etiketli antijenin rasyonel konsantrasyonunu kullanın.

Daha sonra her bir oyuğa 4 mikrolitre serum ekleyin ve son hacmi 1 kat fosfat tamponlu tuzlu su ile 20 mikrolitreye ayarlayın. Ardından, her bir oyuğa 20 mikrolitre etiketli antijen çözeltisi ekleyin ve ışığı önlemek için plakayı sızdırmazlık folyosu ile örtün. Ardından, plakayı 2 saat boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerine aktarın.

Çalkalayıcı durduğunda, plakayı buzdolabında 4 ila 18 saat boyunca 24 santigrat derecede bırakın. Şimdi, her numune için 15 mikrolitre serumu 18 mikrolitre 0.5 molar asetik asit ile karıştırın ve aynı şekilde oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.

Dama tahtası tahlili temelinde, antijen çözeltisini hazırlamak için biyotin sülfo-etiket etiketli antijenin rasyonel konsantrasyonunu kullanın.

Ardından, yeni bir PCR plakasının her bir oyuğuna 35 mikrolitre antijen tamponu ekleyin. Serum karışımının inkübasyon korosu tamamlanmadan hemen önce, antijen plakası üzerindeki her bir oyuğun kenarı boyunca pH dokuzda 3.8 mikrolitre 1 molar Tris tamponu ekleyin.

İnkübasyon bittikten sonra, antijen plakasının her bir oyuğuna 25 mikrolitre asetik asitle muamele edilmiş serumu hızlı bir şekilde aktarın ve çözeltiyi çalkalayın. Ardından, ışığı önlemek için PCR plakasını sızdırmazlık folyosu ile örtün ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bittiğinde, plakayı buzdolabında 4 santigrat dereceye aktarın ve 18 ila 24 saat inkübe edin.

Streptavidin plakasını buzdolabından 4 santigrat derecede çıkarın ve plakanın oda sıcaklığına ulaşmasını bekleyin. Streptavidin plakası oda sıcaklığına ulaştıktan sonra, her bir oyuğa 150 mikrolitre% 3 bloker A ekleyin ve PCR plakasını sızdırmazlık folyosu ile örtün ve gece boyunca buzdolabında inkübe edin.

Ertesi gün, streptavidin plakasını buzdolabından çıkarın ve tamponu kuyulardan çıkarın. Ardından, kalan tamponun ıslanması için plakayı kuru kağıt havluların üzerine baş aşağı koyarak kurulayın. Ardından, art arda üç yıkama için kuyuyu yıkamak için 150 mikrolitre 1 katlı PBST tamponu ekleyin.

Daha sonra, streptavidin plakasının her bir oyuğunda 30 mikrolitre serum antijeni inkübe edin ve ışığı önlemek için plakayı folyo ile örtün. Ardından, plakayı bir saat boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerine aktarın. Bir saat sonra, serum antijeni inkübatını plakadan atın ve kuyuyu üç kez yıkamak için 150 mikrolitre 1 kat PBST tamponu ekleyin. Yıkama bittiğinde, bir plaka okuyucuda okumak için her bir oyuğa 150 mikrolitre okuma tamponu ekleyin.