Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, hücre çekirdeği arayüzünün mekanik özelliklerini ve çevreleyen hücre iskeleti ile olan fiziksel bağlantısını ölçmektir. Bu, şeffaf bir silikon membran üzerine ekilmiş hücrelere mekanik gerilim uygulanarak ve indüklenen nükleer deformasyonların görüntülenmesiyle gerçekleştirilir. Nükleer deformasyonlardaki artış, nükleer sertliğin azaldığına karşılık gelir; zira çekirdek ve hücre iskeleti arasındaki bağlantıdaki değişiklikler de indüklenen nükleer deformasyonları etkileyebilir.

Sitoskelet ile çekirdek arasındaki hücre içi kuvvet iletimi, sitoskelete yerelleştirilmiş gerinim uygulanarak doğrudan incelenir. Ardından, floresanla işaretlenmiş NU çekirdek ve sitoskeletal yapıların yer değiştirmesi görüntülenir. Hücre çekirdeklerinin çevredeki sitoskelete göre sertliğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Substrat gerinim deneylerine dayanarak, mikroiğne manipülasyon testi, nükleo-sitoskeletal etkileşimin bozulmasının hücre içi kuvvet iletiminde kusurlara yol açtığını ortaya koymaktadır. Bu tekniklerin, izole çekirdeklerin mikro pipet aspirasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, normal hücresel mimariyi bozmadan, sağlam yaşayan hücrelerin nükleer mekaniğinin ölçülmesine olanak sağlamalarıdır. Bu yöntemler, nükleer zar bileşimindeki değişikliklerin çekirdeğin mekanik özelliklerini nasıl etkileyebileceğine dair içgörü sağlayabilir.

Bunlar ayrıca, LA nöropatileri veya kanser gibi hastalıklar bağlamında nükleer mekaniğin rolünü incelemek için de uygulanabilirler. Her gerilme kabı, üç inç çapında özel yapım tabansız bir plastik kap ve hücre kültürü substratı olarak hizmet eden bir silikon membranı tutmak için bir plastik O-ringden oluşur. Gerilme kabının hazırlanması için, dört inç çarpı dört inç boyutundaki bir silikon membran parçasını bir O-ring ile kabın arasına sıkıştırın, fazla membranı dikkatlice kesin, gerilme kabını deiyonize su ile durulayın ve ardından silikon membranı hücre dışı matris molekülleri ile kaplamadan önce kabı otoklavlayın; membranın dış kısmının alt orta noktasına bir referans noktası işaretleyin.

Bu işaretleyici, tek eksenli gerinim uygulamasına yönelik gerinim deneyleri sırasında aynı hücrelerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Membranın tek bir boyutta oluşumunu kısıtlamak için referans noktasının etrafına iki paralel scotch bant şeridi uygulanır. Optimal hücre yapışması sağlamak için, silikon membranları mililitre başına üç mikrogram fibronectin veya herhangi bir uygun hücre dışı matris proteini ile kaplayın.

Strain kabını ters çevrilmiş 10 santimetrelik polistiren bir kapla kapatın ve ertesi güne kadar dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Fazla proteini uzaklaştırmak için membranı bir kez PBS ile durulayın. Kabı 10 mililitre büyüme besiyeri ile doldurun ve kenara ayırın.

Kaplanmış silikon membran kap hazırlandıktan sonra, hücreler %0.05 tripsin ile tripsinize edilir ve adherent hücreler büyüme besiyeri içerisinde kabın üzerine ekilir. Bu prosedür fare embriyonik hücreleri ile gösterilmiştir.

Fibroblastlar veya mes hücreleri, normal kültür koşulları altında 24 ila 48 saat boyunca inkübe edilir. Substrat gerilme deneyleri için donatılmış bir ters mikroskop, mikroskop tablasına oturan bir taban plakasından oluşan bir gerilme cihazı içerir. Plaka, silikon membranın merkezi bölümüne gerilme uygulamaya yarayan merkezi silindirik bir platini tutar.

Cihaz ayrıca, gerilme kabını tutan ve dört kılavuz pim üzerinde yukarı aşağı kayabilen hareketli bir plakaya ve yük uygulamak için beş pound ağırlığa sahiptir. Çekirdekleri görüntülemek için, gerilme kabındaki hücreleri mililitre başına bir mikrogram Hoechst boyası ile 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, besiyerini aspire ederek çekin ve yerine 25 mM HEPES içeren 15 mL fenol kırmızısı içermeyen büyüme besiyeri ekleyin.

Ardından, petri kabını kap tutucuya vidalayın ve silikon membranın merkezi Platin boyunca kaymasını sağlamak için membranın alt kısmının çevresine dikkatlice gres sürün. Membranın orta bölümünün temiz kaldığından emin olun. Taban plakasını mikroskop sahne plakasına yerleştirin ve kap tutucuyu dikkatlice taban plakasına monte edin.

Başlangıçtaki dinlenme konumunda, gerilme kabının silikon membranının merkezi platin üzerinde gevşekçe durduğundan emin olun. Ardından, silikon membranın altına odaklanın ve merkezdeki siyah referans noktasını bulun. Bu nokta, tüm görüntüleme işlemlerinde başlangıç noktası olarak hizmet edecek ve gerilme sırasında ve sonrasında aynı hücrelerin konumlandırılmasına yardımcı olacaktır.

Bu görüntüde, merkezi nokta görüş alanının tamamını doldurmaktadır. Noktanın kenarından başlayarak, hücreleri ve silikon membranın üst kısmını görüntülemek için odağı ayarlayın. Çekirdekleri merkezi konumda olan, iyi yayılmış hücreleri bulun.

Hücre hattına ve silikon membrana odaklanan bir yüzey kontrast görüntüsü alın. Ardından, çekirdeğin merkez düzlemine odaklanan bir nükleer kanca boyası floresan görüntüsü alın. Beş ila 15 hücrenin görüntüsü alındıktan sonra, merkez noktasına geri dönün.

Ağırlığı, gerilme kabına yavaşça uygulayarak üniform bir gerilme uygulaması sağlayın. Kabın merkezinde. Uygulanan maksimum substrat gerilmesi, dikey hizalama pimlerine yerleştirilen naylon ara parçalarla sınırlandırılmıştır; gerilme uygulamasının ardından silikon membranın altına odaklanın ve referans noktayı tekrar bulun, işlemlere noktadan başlayın.

Aynı hücreleri yeniden konumlandırın ve başlangıç görüntülerinin odak düzlemlerini yakından eşleştirmeye çalışarak, tam gerilme altındaki her bir hücrenin çekirdeği için tekrar faz kontrastı ve floresan görüntüsü alın. Hücrenin yabancı substrata aktif olarak yeniden şekillenmesini ve adapte olmasını önlemek için bu işlem 10 dakikayı geçmemelidir. Tüm ilgili görüntüler alındıktan sonra, mikroskop tablasını başlangıç noktasına geri getirin.

Ağırlığı kap tutucu plakadan dikkatlice kaldırın ve gerekirse silikon membranın gevşemesini bekleyin. Süzgeç kabını başlangıç konumuna gelene kadar nazikçe yukarı itin. Ardından faz kontrastı ve floresans görüntülerini alın.

Germe sonrası hücrelerin görüntüleri, tıpkı germe görüntüleri için açıklandığı gibi, hücrelerin ve floresanla işaretlenmiş çekirdeklerin germe uygulaması öncesindeki, sırasındaki ve sonrasındaki görüntüleri üzerinden analiz edilerek normalize edilmiş çekirdek germesi hesaplanır. Bu gösterimde, analiz için özel olarak yazılmış bir MATLAB betiği kullanılmıştır; ancak uygulanan substrat germesini manuel olarak hesaplamak için birkaç alternatif seçenek mevcuttur; karşılık gelen germe öncesi ve germe sonrası görüntüler arasında, membran üzerinde yer alan üç ila altı kontrol noktasının konumları eşleştirilir. MATLAB programı daha sonra, germe öncesi ve tam germe görüntüleri arasındaki eşleşen kontrol noktalarının konumlarını karşılaştırarak uygulanan membran germesini hesaplar.

Pre-train ve post strain görüntüleri arasındaki artık gerinim için konumlar da karşılaştırılır. Kontrol noktaları, hasarlı veya ayrılan hücrelerin tespit edilmesine yardımcı olmak amacıyla görüntü çiftlerini kaydırmak için eş zamanlı olarak kullanılır. Ardından, her bir çekirdek için nükleer gerinimi hesaplayan ayrı bir MATLAB programı kullanarak çekirdekleri manuel olarak seçin.

Bu işlem, karşılıklı gelen gerilme öncesi ve sonrası floresan görüntüleri arasında çekirdek boyutunun eşleştirilmesiyle veya farklı deneyler arasında uygulanan membran gerilmesindeki küçük varyasyonları hesaba katmak için çekirdek içi markerların eşleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Sonuçlar, normalize edilmiş çekirdek gerilmesi olarak ifade edilir. Bu, her bir çekirdek için hesaplanan indüklenmiş çekirdek gerilmesinin, uygulanan membran gerilmesine oranı olarak tanımlanır.

MATLAB betikleri, talep üzerine lambing laboratuvarından temin edilebilir. Son adım olarak, her bir çekirdek doğrulanır ve gerinim uygulaması sırasında ayrılan veya hasar gören hücrelerden elde edilen ölçümler hariç tutulur. Silikon membran üzerindeki iki ayrı bölgeye yayılan MEF'ler, burada örneği gösterilen %20UNI eksenel gerinim uygulamasından önce, uygulama sırasında ve sonrasında faz kontrastlı ve floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir; bu görüntü, gerinim uygulamasına herhangi bir hasar veya ayrılma olmadan hayatta kalan hücrelerden elde edilen geçerli çekirdeklerle gerçekleştirilmiş başarılı bir deney örneğidir.

Buna karşılık, burada gösterilen hücreler gerinim uygulaması sırasında büzüşmüş veya kısmen ayrılmış olup analiz dışı bırakılmıştır. Sol taraftaki hücre, sitoskeletal hasar ve nükleer çökme belirtileri gösterirken, sağ taraftaki hücre gerinim uygulaması sırasında kısmen ayrılmakta ve büzüşmektedir. Bu durum, aşırı gerinimin bir göstergesi olabilir.

Burada, Lamin AC eksikliği olan farelerin farklı meth hücre hatlarından oluşan bir panelde normalize edilmiş nükleer gerinim analizi gösterilmiştir; hücreler, vahşi tip kardeşlerden alınan meth hücreleri ile karşılaştırmalı olarak ya boş bir vektörü ya da vahşi tip lamin A'yı ektopik olarak eksprese etmektedir. Nükleer zar proteinlerinin ekspresyon kaybı, normalize edilmiş nükleer gerinimin artmasına neden olan Lamin AC ile ilişkilidir. Bu durum, vahşi tip Lamin A'nın yeniden tanıtılmasıyla kısmen veya tamamen geri döndürülebilen nükleer sertlikteki azalmaya işaret eder. Mikro iğne manipülasyon deneyine hazırlanmak için, 35 mm'lik cam tabanlı bir hücre kültürü kabını düşük konsantrasyonlu fibronectin ile 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından kabı iki kez HBSS ile yıkayın ve kaba 2 mL büyüme ortamı ekleyin.

Ardından, fare embriyonik fibroblastları %0,05 tripsin ile tripsinize edilir ve iki mililitre büyüme ortamı içerisinde, fibronektin kaplı cam tabanlı kaba ekilir. Tekil, yapışkan ve konfluent olmayan hücreler elde etmek için hücreler gece boyunca inkübatörde bekletilir; hücreleri boyamak için büyüme ortamına MitoTracker mitokondriyal boya ve Hoechst nükleer boya eklenir. Bu büyüme ortamı hücrelere eklenir ve ardından inkübasyon işlemi uygulanır.

Ardından, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca Hank's dengeli tuzlu çözeltisi içinde inkübe ederek yıkayın. Daha sonra, görüntüleme için hücrelere 25 millimolar HEPES içeren fenol kırmızısı içermeyen büyüme ortamı ekleyin.

Mikroiğne deneyi için, önceden çekilmiş bir mikroiğneyi, dijital şarj coupled cihazlı bir kamera ve odaklama sistemine sahip ters mikroskoba bağlı bir mikromanipülatöre yerleştirin. Mikroiğneyi tek bir hücrenin yakınına odaklayın. Mikroiğne henüz hücre iskeletine yerleştirilmeden önce tek hücrenin bir görüntüsünü alın.

Faz kontrastında, kancaların 3 3, 3 4 2 boyamasının bir floresan görüntüsünü ve mitokondriyal boyamanın bir floresan görüntüsünü, ters mikroskop üzerinde 60 x objektif ve mikromanipülatör kullanarak elde edin; ardından mikroiğneyi, çekirdek periferisinden sabit bir uzaklıkta olacak şekilde bir hücrenin sitoplazmasına dikkatlice yerleştirin ve bir faz kontrast görüntüsü, kancaların 3 3, 3 4, 2 boyamasının bir floresan görüntüsü ve mitokondriyal boyamanın bir floresan görüntüsü alın. Bilgisayar kontrollü mikromanipülatörü kullanarak, her 10 saniyede bir otomatik olarak görüntüler alırken mikroiğneyi saniyede bir mikrometre hızla hücre periferisine doğru belirli bir mesafe hareket ettirin.

Mikroiğne hücre çevresine doğru belirli bir mesafeye doğru hareket ederken, tutarlı bir mikro-manipülasyon sağlamak için mikro manipülatör bir bilgisayar aracılığıyla kontrol edilmelidir. İşlemler, mikroiğne çıkarıldıktan sonra nihai görüntülerin alınmasıyla tamamlanır; mikroiğne manipülasyonundan önce, manipülasyon sırasında ve sonrasında elde edilen çekirdek ve hücre iskeletinin floresan işaretli özelliklerine ait görüntüler, küçük hücre içi bölgelerin yer değiştirmesini hesaplamak için analiz edilir. Bu gösterimde analiz için özel olarak yazılmış bir MATLAB betiği kullanılmıştır, ancak başka çeşitli seçenekler de mevcuttur.

Mikroiğnenin oluşturduğu yer değiştirmeyi ölçmek için kullanılan MATLAB betiği, talep üzerine lambing laboratuvarından temin edilebilir. MATLAB programı, floresan işaretli özelliklerin orijinal konumu ile yeni belirlenen konumları arasındaki kaymayı hesaplamak için normalize edilmiş çapraz korelasyon algoritması kullanır. Yer değiştirmeler daha sonra vektör haritaları olarak görüntülenir ve sayısal değerler olarak saklanır.

Bir sonraki adım, elde edilen yer değiştirme vektör haritalarını kullanaraklele cytoskeleton veya çekirdek içindeki ortalama yer değiştirmeleri matlab ile belirlemektir. İlk olarak, gerinim uygulama bölgesindeki cytoskeleton içinde üç veya daha fazla nokta seçin. Yer değiştirme vektör haritasında, mikro iğne uygulaması sırasında uygulama bölgesi yakınında oluşan cytoskeletal gerinim miktarını belirlemek için ortalama sayısal değeri alın.

Ardından, çekirdek içerisinde gerinim uygulama bölgesine yakın üç veya daha fazla nokta seçin ve ortalama değeri hesaplayın. Bu değer, mikroiğne uygulama bölgesine yakın çekirdek gerinimi miktarını temsil eder. Aynı yöntemi kullanarak, bu bölgelerden seçilen noktalardan yararlanarak gerinim uygulama bölgesinden uzaktaki çekirdek ve hücre iskeleti gerinimini belirleyin.

Hücre içi kuvvet iletimini ölçmek için bir mikroiğne manipülasyon deneyi gerçekleştirilmiştir. Burada, mavi nükleer boya ve MIT tracker green mitokondriyal boya ile işaretlenmiş bir fibroblastın faz kontrast görüntüleri ve floresan görüntüleri gösterilmektedir. Bir mikroiğne, çekirdekten belirli bir uzaklıktale sitoskelete yerleştirilmiş ve ardından hücre periferine doğru hareket ettirilmiştir.

Sitoskeletal gerilme öncesinde, sırasında ve sonrasında mitokondriyal yer değiştirme takip edildi ve ardından bu yer değiştirmeler vektörler olarak grafiğe döküldü. Her bir vektör, orijinal konum ile yeni belirlenen konum arasındaki kayma olarak hesaplanan yer değiştirmeyi temsil etmektedir. Düşük görüntü yoğunluğuna veya yetersiz dokuya sahip bölgeler analiz dışı bırakılmıştır.

Ardından, hem kontrol fibroblastları hem de fibroblastlar için, gerinim uygulama bölgesinden artan uzaklıktaki seçili alanlarda hücre iskeleti ve nükleer yer değiştirme miktarları belirlendi. Nükleo-sitokeletal bağlantısı sağlam olan hücrelerde, kuvvetler tüm hücre boyunca iletilir ve bu durum, gerinim uygulama bölgesinden uzaklaştıkça yavaşça azalan indüklenmiş nükleer ve sitokeletal deformasyonla sonuçlanır. Buna karşılık, nükleo-sitokeletal bağlantısı bozulmuş hücreler, uygulama bölgesinin yakınında lokalize yer değiştirme gösterirken, daha uzak bölgelerde çok az indüklenmiş deformasyon sergiler.

Hem kontrol fibroblastları hem de nükleo-sitoskeletal etkileşimi bozulmuş fibroblastlar için mikroiğne giriş bölgesinde benzer sitoskeletal gerinim uygulaması gözlemlenmiştir. Bununla birlikte, diğer bölgelerde indüklenen nükleer ve sitoskeletal yer değiştirme, nükleo-sitoskeletal etkileşimi bozulmuş fibroblastlarda kontrol hücrelerine göre anlamlı derecede daha küçüklemiştir. Bu nedenle, gerinim uygulama bölgesinden uzaklaştıkça sitoskeletal ve nükleer yer değiştirmenin azalması, sitoskelet ile çekirdek arasındaki zorunlu iletimin bozulduğunu göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, nükleer mekaniğin ve çekirdek ilele cytoskeleton arasındaki hücre içi kuvvet iletiminin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu teknikleri, nükleer zar proteinlerindeki mutasyonların etkilerini veya gelişim sırasında ya da kanserde meydana gelen nükleer zar kompozisyonundaki değişiklikleri incelemek için kullanabilirsiniz.