Name: Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde nükleer ve sitoskeletal deformasyonları ölçmek için mikroskopi tabanlı iki bağımsız teknik kullanarak hücre mekaniğini inceleyin. Bu yöntemler nükleer sertliği ve hücre içi kuvvet iletimini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık (R01 HL082792 ve R01 NS059348) ve Brigham ve Kadın Hastanesi Kalp ve Damar Liderlik Grubu Ödülü Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li>
<li>Mejat, A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">LINC complexes in health and disease.</a> Nucleus. 1, 40-52 (2010).</li>
<li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li>
<li>Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+strain+field+in+endothelial+cells+subjected+to+uniaxial+deformation+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate.</a> Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+nuclear+shape+and+impaired+mechanotransduction+in+emerin-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells.</a> J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).</li>
<li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells%3A+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li>
<li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488, 459-469 (1995).</li>
<li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins%2C+cytoskeletal+filaments%2C+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Yüzey gerilme tahlil Gerilme uygulamanın başarıyla mekanik strese maruz hücre kaynaklı nükleer deformasyonlar ve çalışma nükleer sertliği belirli bir çekirdek zarı proteinleri katkısını araştırmak için bize ve diğer gruplar tarafından kullanılmıştır. 4-8 Bu tekniğin avantajı, mekanik özellikleri probları çekirdekleri, normal hücresel ve hücre iskeleti çevre ve yaşam yüzey gerilme uygulama gibi, kas ve kan damarı duvarlarının müteahhitlik gibi birçok dokuda bulunan fizyolojik yük uygu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td></tr><tr><td> MitoTracker Kırmızı FM ve Yeşil FM </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 ve M-7514 </td></tr><tr><td> Hoechst 33.342 </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td></tr><tr><td> Hank Tamponlu Tuz Tuzlu </td><td> Invitrogen </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Fenol ücretsiz, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21063 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Aleken Biyolojik </td><td> FBSS500 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Sigma </td><td> P0781-100ML </td></tr><tr><td> Borosilikat Cam ile filament </td><td> Sutter Enstrüman </td><td> BF100-78-10 </td></tr><tr><td> &quot;/ Parlak takviyeli olmayan silikon kaplama, 0.005 Parlak </td><td> Özel İmalat A.Ş. </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun Fosfat Tamponlu Salin </td><td> Invitrogen </td><td> 14200 </td></tr><tr><td> 35 mm cam alt kültür yemekleri (FluoroDish) </td><td> Dünya Hassas Aletler A.Ş. </td><td> FD35-100 </td></tr><tr><td> Braycote 804 Vakum Gres </td><td> SPI kaynakları </td><td> 05133A-AB </td></tr></tbody></table>

fazlararası hücre Çekirdek mekanik Özellikleri probe biyofiziksel tahliller: yüzey gerilme uygulama ve microneedle manipülasyon

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Çoğu ökaryotik hücre çekirdeği büyük organel ve genellikle çevresindeki hücre iskeletinin daha 2 ila 10 kat daha sert, dolayısıyla çekirdeğin fiziksel özelliklerini, fizyolojik ve patolojik koşullar altında hücre genel biyomekanik davranış önemli ölçüde katkıda bulunur. Örneğin, nötrofil göç ve kanser hücreleri istila, nükleer sertlik dokuların içindeki dar alanlarda yoluyla ekstravazasyonu veya geçiş sırasında büyük bir engel teşkil edebilir. 1 Öte yandan, böyle bir kas gibi mekanik olarak aktif bir doku hücrelerinin çekirdeği için yeterli yapısal destek gerektirir tekrarlayan mekanik stres dayanacak. Önemlisi, çekirdeğinde sıkı bir şekilde hücresel mimarisine entegre; fiziksel polarize hücreler, nöromüsküler kavşaklarda sinaptik çekirdekleri örneğin çekirdeğin hücre içi hareket ve konumlandırma için kritik bir gereklilik, çevredeki hücre iskeletinin, bağlı, ya da göç hücrelerinde 2 şaşırtıcı değil, nükleer sertliği ve Nucleo iskelet kaplin belirlenmesinde kritik bir rol oynayan lamins ve nesprins gibi çekirdek zarı proteinleri mutasyonlar, bir numara da dahil olmak üzere insan hastalıkları, neden son zamanlarda gösterilen edilmiştir Emery- Dreifuss müsküler distrofi, kol, bacak-girdle musküler distrofi ve dilate kardiyomiyopati 3 biyofiziksel fonksiyonu çeşitli çekirdek zarı proteinleri ve belirli mutasyonların etkisini araştırmak için, tek, canlı hücrelerin çekirdeğinde fiziksel özelliklerini incelemek için deneysel yöntemler geliştirdik küresel veya lokalize mekanik pertürbasyon tabi. Tam olarak uygulandığında yüzey gerilme uygulama yanıt indüklenen nükleer deformasyonlar Ölçüm çekirdeğin deformabilitesi hakkında önemli bilgiler verir ve farklı mutasyon veya özel nükleer zarf proteinlerin eksik hücre hatları arasında kantitatif karşılaştırılmasına olanak sağlar. Bir microneedle lokalize sitoskeletal gerginlik uygulaması bu testte tamamlamak için kullanılır ve çekirdek ve hücre iskeletinin arasındaki hücre içi kuvvet aktarımı hakkında ek bilgi verim alınabilir. Bozulmamış canlı hücreler nükleer mekaniğinin incelenmesi, normal hücre içi mimariyi korur ve izole çekirdekleri ile çalışırken ortaya çıkabilecek potansiyel eserler önler. Ayrıca, yüzey gerilme uygulama, fizyolojik stres, kas hücreleri ve diğer dokulara (örneğin, damar düz kas hücrelerinin damar zorlamalara maruz) tarafından deneyimli iyi bir model sunar. Son olarak, bu araçların, öncelikle nükleer mekaniği çalışma geliştirilmiştir ise aynı zamanda iskelet proteinleri ve mechanotransduction sinyal fonksiyonu araştırmak için uygulanan olabilir.

Biz, küresel ya da lokalize gerginlik uygulama yanıt tek, yaşayan yapışık hücrelere kaynaklı nükleer ve iskelet deformasyonları ölçmek için, iki bağımsız, mikroskop tabanlı araçlar sunuyoruz. Bu teknikler, nükleer sertliği belirlemek için (yani, deformabilitesi) ve, çekirdek ve hücre iskeletinin arasındaki hücre içi kuvvet iletim prob kullanılır.

Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon

Çoğu ökaryotik hücrede çekirdek en büyük organeldir ve genellikle çevresindeki hücre iskeletinden 2 ila 10 kat daha serttir; sonuç olarak, ...

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, hücre çekirdeği arayüzünün mekanik özelliklerini ve çevredeki hücre iskeleti ile olan fiziksel bağlantısını ölçmektir. Bu işlem, şeffaf bir silikon membran üzerine ekilmiş hücrelere mekanik gerinim uygulanarak ve ortaya çıkan nükleer deformasyonların görüntülenmesiyle gerçekleştirilir. Çekirdek ve hücre iskeleti arasındaki etkileşimdeki değişiklikler de indüklenen nükleer deformasyonları etkileyebildiğinden, artan nükleer deformasyonlar azalmış nükleer sertliğe karşılık gelir.Sitokelet ile çekirdek arasındaki hücre içi kuvvet iletimi, sitokelete lokalize gerilme uygulanarak doğrudan incelenir. Ardından, floresanla işaretlenmiş NU çekirdek ve sitokelet yapılarının yer değiştirmesi görüntülenir. Hücre çekirdeklerinin çevreleyen sitokelete göre sertliğini gösteren sonuçlar elde edilir.Substrat gerinim deneylerine dayanarak, mikroiğne manipülasyon analizi, nükleo-sitoskelet etkileşiminin bozulmasının hücre içi kuvvet iletiminde kusurlara yol açtığını ortaya koymaktadır. Bu tekniklerin, izole çekirdeklerin mikro pipet aspirasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, normal hücresel mimariyi bozmadan, canlı ve sağlam hücrelerin çekirdek mekaniği ölçümlerine olanak sağlamalarıdır. Bu yöntemler, nükleer zar bileşimindeki değişikliklerin çekirdeğin mekanik özelliklerini nasıl etkileyebileceğine dair içgörü sağlayabilir.Bunlar ayrıca, LA nöropatileri veya kanser gibi hastalıklar bağlamında nükleer mekaniğin rolünü incelemek için de uygulanabilir. Her gerilme kabı, üç inç çapında özel yapım altı açık plastik bir kap ile hücre kültürü substratı olarak hizmet eden silikon bir membranı tutmak için kullanılan plastik bir O-ringden oluşur. Gerilme kabının hazırlanması için, dört inç boyutunda kare şeklinde bir silikon membran parçasını bir O-ring ile kabın arasına sıkıştırın, fazla membranı dikkatlice kesin, gerilme kabını deiyonize suyla durulayın ve ardından silikon membranı hücre dışı matris molekülleri ile kaplamadan önce kabı otoklavlayın; membranın dış kısmının alt orta noktasına bir referans noktası işaretleyin.Bu işaret, tek eksenli gerinim uygulaması için gerçekleştirilen gerinim deneyleri sırasında aynı hücrelerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Membran oluşumunu tek bir boyutta sınırlamak için referans noktasının etrafına iki paralel şerit halinde scotch bant uygulanır. Optimal hücre yapışmasını sağlamak için, silikon membranları mililitre başına üç mikrogram fibronektin veya uygun herhangi bir hücre dışı matriks proteini ile kaplayın.Suş kabını ters çevrilmiş 10 santimetrelik bir polistiren kapla kapatın ve ertesi güne kadar dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Fazla proteini uzaklaştırmak için membranı bir kez PBS ile durulayın. Kabı 10 mililitre büyüme besiyeri ile doldurup kenara ayırın.Kaplanmış silikon membran kap hazırlandıktan sonra, hücreler %0,05 tripsin ile tripsine edilir ve yapışkan hücreler büyüme ortamı içeren kabın üzerine ekilir. Bu prosedür fare embriyonik hücreleri kullanılarak gösterilmiştir.Fibroblastlar veya mes hücrelerini normal kültür koşulları altında 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Substrat gerilme deneyleri için donatılmış bir ters mikroskop, mikroskop tablasına oturan bir taban plakasından oluşan bir gerilme cihazı içerir. Plaka, silikon membranın merkezi bölümüne gerilme uygulamaya yarayan merkezi silindirik bir platini tutar.Cihaz ayrıca, gerilme kabını tutan ve dört kılavuz pim üzerinde yukarı ve aşağı kayabilen hareketli bir plakaya ve yük uygulamak için beş poundluk bir ağırlığa sahiptir. Çekirdekleri görselleştirmek için, gerilme kabındaki hücreleri mililitre başına bir mikrogram Hoechst boyası ile 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, besiyerini aspire edin ve yerine 25 mM HEPES içeren, fenol kırmızısı içermeyen 15 mL büyüme besiyeri ekleyin.Ardından, kabı kap holderine vidalayın ve silikon membranın merkezi Platin boyunca kaymasını sağlamak için membranın alt kısmının çevresine dikkatlice gres sürün. Membranın orta kısmının temiz kaldığından emin olun. Taban plakasını mikroskop tabla plakası üzerine yerleştirin ve kap holderini dikkatlice taban plakasına monte edin.Başlangıç dinlenme pozisyonunda, gerilme tabağının silikon membranının merkez platin üzerinde gevşekçe durduğundan emin olun. Ardından, silikon membranının altına odaklanın ve merkezdeki siyah referans noktasını bulun. Bu nokta, tüm görüntüleme işlemleri için başlangıç noktası işlevi görecek ve gerilme sırasında ve sonrasında aynı hücrelerin konumlandırılmasına yardımcı olacaktır.Bu görüntüde, merkezi nokta görüş alanının tamamını doldurmaktadır. Noktanın kenarından başlayarak, hücreleri ve silikon membranın üst kısmını görüntülemek için odağı ayarlayın. Çekirdekleri merkezde konumlanmış, iyi yayılmış hücreleri bulun.Hücre ana hattına ve silikon membrana odaklanan bir yüzey kontrast görüntüsü elde edin. Ardından, çekirdeğin merkez düzlemine odaklanarak nükleer kanca boyamasının floresan görüntüsünü alın. Beş ila 15 hücrenin görüntülerini elde ettikten sonra, merkezi noktaya geri dönün.Tekdüze bir gerilme uygulaması sağlamak amacıyla, ağırlığı gerilme kabına yavaşça uygulayın. Kabın merkezinde, uygulanan maksimum substrat gerilmesi, dikey hizalama pimleri üzerine yerleştirilen naylon ara parçalarla sınırlandırılmıştır; gerilme uygulamasının ardından silikon membranın altına odaklanın ve referans noktayı tekrar bulun, işleme noktadan başlayın.Aynı hücreleri tekrar konumlandırın ve her bir hücrenin çekirdeğinin tam gerilim altındaki faz kontrast ve floresan görüntüsünü, başlangıç görüntülerinin odak düzlemleriyle yakından eşleşmeye çalışarak edinin. Hücrenin yabancı substrata aktif yeniden şekillenmesini ve adaptasyonunu önlemek için bu işlem 10 dakikayı geçmemelidir. Tüm karşılık gelen görüntüler elde edildikten sonra, mikroskop tablasını başlangıç noktasına geri getirin.Ağırlığı kap tutucu plakadan dikkatlice kaldırın ve gerekirse silikon membranın gevşemesine izin verin. Süzme kabını başlangıç konumuna gelene kadar nazikçe yukarı itin. Ardından faz kontrast ve floresan görüntülerini elde edin.Gerilme sonrası hücre görüntülerinde, gerilme görüntüleri için açıklandığı gibi, gerilme uygulaması öncesi, sırası ve sonrasındaki hücrelerin ve floresan işaretli çekirdeklerin görüntüleri, normalize edilmiş nükleer gerilmeyi hesaplamak için analiz edilir. Bu gösterimde, analiz için özel olarak yazılmış bir MATLAB betiği kullanılmıştır; ancak uygulanan substrat gerilmesini manuel olarak hesaplamak için çeşitli alternatif seçenekler mevcuttur; bu işlem, karşılık gelen gerilme öncesi ve gerilme sonrası görüntüler arasında membran üzerinde yer alan üç ila altı kontrol noktasının konumlarını eşleştirmeyi içerir. MATLAB programı daha sonra, gerilme öncesi ve tam gerilme görüntüleri arasındaki eşleşen kontrol noktalarının konumlarını karşılaştırarak uygulanan membran gerilmesini hesaplar.Pre-train ve post-strain görüntüler arasındaki artık gerilme için konumlar da karşılaştırılır. Kontrol noktaları, hasarlı veya ayrılan hücrelerin tespit edilmesine yardımcı olmak amacıyla görüntü çiftlerini hizalamak (register) için eş zamanlı olarak kullanılır. Ardından, her bir çekirdek için nükleer gerilmeyi hesaplayan ayrı bir MATLAB programı kullanılarak çekirdekleri manuel olarak seçin.Bu işlem, karşılık gelen gerilme öncesi ve sonrası floresan görüntüler arasında çekirdek boyutunun eşleştirilmesiyle veya farklı deneyler arasında uygulanan membran gerilmesindeki küçük varyasyonları hesaba katmak için çekirdek içi belirteçlerin eşleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Sonuçlar, normalize edilmiş çekirdek gerilmesi olarak ifade edilir. Bu, her bir çekirdek için hesaplanan, indüklenen çekirdek gerilmesinin uygulanan membran gerilmesine oranı olarak tanımlanır.MATLAB betikleri, talep üzerine lambing laboratuvarından temin edilebilir. Son bir adım olarak, her bir çekirdek doğrulanır ve gerinim uygulaması sırasında ayrılan veya hasar gören hücrelerden alınan ölçümler kapsam dışı bırakılır. Silikon membran üzerindeki iki farklı alana yayılmış MEF'ler, burada %20UNI eksenel gerinim uygulamasının öncesinde, sırasında ve sonrasında faz kontrastı ve floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir; bu, gerinim uygulamasına herhangi bir hasar veya ayrılma olmadan dayanan hücrelerin geçerli çekirdeklerini içeren başarılı bir deney örneğidir.Buna karşılık, burada gösterilen hücreler gerinim uygulaması sırasında büzülmüş veya kısmen ayrılmış olup analiz dışı bırakılmıştır. Sol taraftaki hücre,le sitoskeletal hasar ve nükleer çökme belirtileri gösterirken, sağ taraftaki hücre gerinim uygulaması sırasında kısmen ayrılmakta ve büzülmektedir. Bu durum, aşırı gerinimin bir göstergesi olabilir.Burada, Lamin AC eksikliği olan farelerin farklı met hücre hatlarından oluşan bir panelde normalize edilmiş nükleer gerinim analizi gösterilmektedir; hücreler, yaban tipu kardeşlerinden gelen met hücreleriyle karşılaştırıldığında, ya boş bir vektörü ya da yaban tipu lamin A'yı ektopik olarak eksprese ederler; nükleer zar proteinlerinin ekspresyon kaybı, normalize edilmiş nükleer gerinimde artışla sonuçlanır. Bu durum, nükleer sertliğin azaldığını göstermektedir ve bu durum yaban tipu Lamin A'nın yeniden tanıtılmasıyla kısmen veya tamamen geri döndürülebilir. Mikroiğne manipülasyon deneyine hazırlanmak için, 35 milimetrelik cam tabanlı bir hücre kültürü kabını düşük konsantrasyonlu fibronectin ile 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından kabı iki kez HBSS ile yıkayın ve kaba iki mililitre büyüme ortamı ekleyin.Ardından, fare embriyonik fibroblastları %0,05'lik tripsin ile tripsinize edilir ve iki mililitre büyüme ortamı içeren, fibronectin kaplı cam tabanlı kaplara ekilir. Tekil, yapışık ve konfluent olmayan hücreler elde etmek için hücreler gece boyunca inkübatörde bekletilir; hücreleri boyamak için büyüme ortamına MitoTracker mitokondriyal boya ve Hoechst nükleer boya eklenir. Bu büyüme ortamı hücrelere eklenir ve ardından inkübasyon uygulanır.Ardından, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca Hank dengeli tuz çözeltisinde inkübe ederek yıkayın. Daha sonra, görüntüleme için hücrelere 25 millimolar HEPES içeren fenol kırmızısı içermeyen büyüme besiyeri ekleyin.Mikro iğne deneyi için, önceden çekilmiş bir mikro iğneyi, dijital şarj bağlı aygıt kameralı ve odaklamalı bir ters mikroskoba bağlı mikro manipülatöre yerleştirin. Mikro iğneyi tek bir hücrenin yakınına odaklayın. Mikro iğne henüz hücre iskeletine yerleştirilmeden önce tek bir hücrenin bir görüntüsünü alın.Faz kontrastında, kancaların 3 3, 3 4 2 boyamasının bir floresan görüntüsünü ve mitokondriyal boyamanın bir floresan görüntüsünü 60 x objektifli bir ters mikroskop altında alın; mikro manipülatör kullanarak mikro iğneyi, nükleer periferiden sabit bir uzaklıkta olan bir hücrenin sitoplazmasına dikkatlice yerleştirin ve bir faz kontrast görüntüsü, kancaların 3 3, 3 4, 2 boyamasının bir floresan görüntüsü ve mitokondriyal boyamanın bir floresan görüntüsünü alın. Bilgisayar kontrollü mikro manipülatörü kullanarak, her 10 saniyede bir otomatik olarak görüntü alırken, mikro iğneyi saniyede bir mikrometre hızla hücre periferisine doğru belirli bir mesafe kadar hareket ettirin.Mikroiğne hücre çevresine doğru belirli bir mesafeye hareket ederken, tutarlı bir mikro-manipülasyon gerçekleştirmek için mikro manipülatör bir bilgisayar aracılığıyla kontrol edilmelidir. İşlemler, mikroiğne geri çekildikten sonra görüntülerin alınmasıyla tamamlanır; mikroiğne manipülasyonundan önce, manipülasyon sırasında ve sonrasında elde edilen çekirdek ile hücre iskeletinin floresan işaretli özelliklerine ait görüntüler, küçük hücre içi bölgelerin yer değiştirme miktarını hesaplamak için analiz edilir. Bu gösterimde analiz için özel olarak yazılmış bir MATLAB betiği kullanılmıştır ancak başka çeşitli seçenekler de mevcuttur.Mikro iğnenin oluşturduğu yer değiştirmeyi ölçmek için kullanılan MATLAB betiği, talep üzerine lambing laboratuvarından temin edilebilir. MATLAB programı, floresan işaretli özelliklerin orijinal konumu ile yeni belirlenen konumları arasındaki kaymayı hesaplamak için normalize edilmiş çapraz korelasyon algoritması kullanır. Yer değiştirmeler daha sonra vektör haritaları olarak görüntülenir ve sayısal değerler olarak kaydedilir.Bir sonraki adım, elde edilen yer değiştirme vektör haritalarını kullanarak sitoskelet veya çekirdek içindeki ortalama yer değiştirmeleri matlab ile belirlemektir. İlk olarak, gerinim uygulama bölgesindeki sitoskelet içinde üç veya daha fazla nokta seçin. Yer değiştirme vektör haritasında, mikro iğne uygulaması sırasında uygulama bölgesinin yakınında oluşan sitoskeletal gerinim miktarını belirlemek için ortalama sayısal değeri alın.Ardından, çekirdek içinde, gerilimin uygulandığı bölgeye yakın üç veya daha fazla nokta seçin ve ortalama değeri alın. Bu değer, mikro-iğne uygulama bölgesinin yakınındaki nükleer gerilimin miktarını temsil eder. Aynı yöntemi kullanarak, ilgili bölgelerden seçilen noktalardan yararlanarak gerilimin uygulandığı bölgeden uzaktaki nükleer ve hücre iskeleti gerilimini belirleyin.Hücre içi kuvvet iletimini ölçmek için bir mikroiğne manipülasyon deneyi gerçekleştirilmiştir. Burada, mavi çekirdek boyası ve MIT tracker green mitokondriyal boyası ile işaretlenmiş bir fibroblastın faz kontrast ve floresan görüntüleri gösterilmektedir. Bir mikroiğne, çekirdekten belirli bir uzaklıkta hücre iskeletine yerleştirilmiş ve ardından hücre çevresine doğru hareket ettirilmiştir.Mitokondriyal yer değiştirme, sitoskeletal gerilme öncesinde, sırasında ve sonrasında takip edilmiş ve ardından yer değiştirmeler vektörler olarak grafiğe dökülmüştür. Her vektör, orijinal konum ile yeni belirlenen konum arasındaki kayma olarak hesaplanan yer değiştirmeyi temsil eder. Düşük görüntü yoğunluğuna sahip veya dokusu yetersiz olan bölgeler analiz dışında tutulmuştur.Ardından, hem kontrol fibroblastları hem de fibroblastlar için, gerilme uygulama noktasından artan uzaklıktaki seçili alanlardale sitoskeletal ve nükleer yer değiştirmeler nicelleştirilmiştir. Nükleo-sitoskeletal bağlantısı sağlam olan hücrelerde kuvvetler tüm hücre boyunca iletilir; bu durum, gerilme uygulama noktasından uzaklaştıkça yavaşça azalan indüklenmiş nükleer ve sitoskeletal deformasyonla sonuçlanır. Buna karşılık, nükleo-sitoskeletal bağlantısı bozulmuş olan hücreler, uygulama noktasının yakınında lokalize yer değiştirme ve daha uzak bölgelerde ise sadece çok az indüklenmiş deformasyon gösterir.Hem kontrol fibroblastları hem de çekirdek-iskelet bağlantısı bozulmuş fibroblastlar için mikroiğne giriş noktasında benzer sitoskeletal gerinim uygulaması gözlemlenmiştir. Bununla birlikte, diğer bölgelerde indüklenen nükleer ve sitoskeletal yer değiştirme, çekirdek-iskelet bağlantısı bozulmuş fibroblastlarda kontrol hücrelerine göre anlamlı düzeyde daha düşük çıkmıştır. Bu nedenle, gerinim uygulama noktasından uzaklaştıkça sitoskeletal ve nükleer yer değiştirmenin azalması, sitoskelet ve çekirdek arasındaki zorunlu iletimin bozulduğunu göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, nükleer mekaniğin ve çekirdek ile hücre iskeleti arasındaki hücre içi kuvvet iletiminin nasıl ölçüleceği konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmanız gerekir. Bu teknikleri, nükleer zar proteinlerindeki mutasyonların etkilerini veya gelişim sırasında ya da kanserde meydana gelen nükleer zar bileşimindeki değişiklikleri incelemek için kullanabilirsiniz.

biophysical-assays-to-probe-mechanical-properties-interphase-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İşte biz cep sertliği ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşımın genel prensip hücre yüzeyine bir mikropipet yoluyla uygulanan iyi tanımlanmış bir negatif basınca tepki olarak zar deformasyon ölçmektir. Bu yöntem substrat bağlı hücrelerin biyomekanik özelliklerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Substrat bağlı Hücrelerinin Mikropipet Aspirasyon Hücre Rijitlik tahmin etmek

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Bu makalede kompleks anizotropik çift eksenli mekanik deformasyona karşı tek bir hücre yanıtları araştırmak ve biyolojik dokuların mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılabilen yeni bir germe platformu sunmak.

Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Bu protokol için doğrudan bir yaşam Hücre çekirdeğinde kontrollü bir kuvvet uygulamak için micropipette yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil sorgulama yaşayan, yapisan hücredeki nükleer mekanik özellikleri sağlar.

Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda

Daha önce tasarlanmış bir cihazı kullanarak bağlı hücrelere mekanik gerilme uygulamak için, bu yazıda bir yeniden tasarlanan substratum geometrisi ve 100 x yağ daldırma amacı ile gergin hücrelerin yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüleme için özelleştirilmiş bir cihaz açıklanmaktadır.

Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

İğnesiz su jeti teknolojisi ile hücre enjeksiyonu yöntemini, hücresel canlılık, proliferasyon ve elastikiyet ölçümleri açısından doğum sonrası araştırmaların bir sekeli ile birlikte sunuyoruz.

Domuz Yağ Dokusundan Türemiş Stroma Hücrelerinin Su Jeti Teknolojisi ile Enjeksiyonu

Bu çalışma, sitoplazmaya verilen manyetik mikroboncuklar yoluyla hücre çekirdeğine doğrudan mekanik kuvvet uygulamak ve eşzamanlı canlı hücre floresan görüntülemesi yapmak için yeni bir protokol sunmaktadır.

Çekirdek Mekanobiyolojisini Incelemek için 3D Manyetik Kuvvet Aktüatörü ve Çok Fonksiyonlu Floresan Görüntülemeyi Birleştirmek

Burada sunulan, mekano-düğüm-gözenek algılama (mekano-NPS) adı verilen elektronik tabanlı bir mikroakışkan platform kullanarak tek hücreleri mekanik olarak fenotiplemek için bir yöntemdir. Bu platform, hücrelerin hem elastik hem de viskoz biyofiziksel özelliklerini ölçerken 1-10 hücre / s'nin ılımlı verimini korur.

Mekano-Düğüm-Gözenek Algılama: Çok Parametreli Tek Hücreli Viskoelastik Ölçümler için Hızlı, Etiketsiz Bir Platform

Mekanik stres altında hücresel davranışın araştırılması, hücresel mekanik ve mekanobiyolojideki ilerlemeler için çok önemlidir. Kontrollü mekanik stimülasyonu tek hücrelerde hücre içi sinyallemenin kapsamlı analizi ile birleştiren yeni bir yöntem olan Floresan Mikropipet Aspirasyonu (fMPA) tekniğini sunuyoruz. Bu teknik, canlı hücre mekanobiyolojisinin yeni derinlemesine çalışmalarını araştırır.

Kırmızı Kan Hücresi Mekanosalgılamasını Araştırmak için Floresan Mikropipet Aspirasyon Testi

Öğrenin, canlı hücrelerde nükleer ve sitoskeletal deformasyonları ölçmek için mikroskopi tabanlı iki bağımsız teknik kullanarak hücre mekaniğini inceleyin. Bu yöntemler nükleer sertliği ve hücre içi kuvvet iletimini değerlendirir.

Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon

Daha fazla video keşfet