JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:44 dk • July 8th, 2025
Patojenik bir parazit ile enfekte olmuş sabit ve geçirgen epitel hücreleri ile başlayın.
Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir engelleme tamponu ekleyin.
Özellikle parazitin proteinleri ile etkileşime giren fare poliklonal birincil antikorları ile kaplama.
Parazitik proteine bağlı birincil antikorlarla etkileşime giren uzak kırmızı florofor işaretli ikincil antikorlar ekleyin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın. Konak-protein etiketlemesi sırasında çapraz reaktiviteyi en aza indirerek, birincil antikorlara bağlanan anti-fare antikorları ile bloklayın.
Epitel hücreleri içinde konakçı ribonükleoproteinleri hedef alan fare monoklonal primer antikorları ekleyin.
Sırasıyla konakçı proteine bağlı primer antikorların ve aktinin etiketlenmesini kolaylaştıran, yeşil florofor etiketli ikincil antikorlar ve kırmızı florofor konjuge phalloidin karışımı ile kaplayın.
Bir tampon ile yıkayın. Konakçı çekirdeğe, parazit çekirdeğine ve kinetoplasta mavi bir renk veren DNA lekesi içeren bir ortam kullanarak monte edin.
Numuneleri konfokal bir mikroskop kullanarak analiz edin. Çift etiketli immünofloresan tekniği, yeşil konak proteinlerini ve kırmızı parazitik proteinleri göstererek bunların kesin hücre altı lokalizasyonunu sağlar.
LLC-MK2 hücrelerini, UV ile sterilize edilmiş yuvarlak lameller içeren 24 oyuklu plakalara ekleyin ve 16 saat boyunca oturmalarına izin verin. Daha sonra hücreleri enfekte etmek için, her bir oyuğa T. cruzi içeren süpernatan ekleyin ve altı saat inkübe edin. Daha sonra, enfekte olmuş ve enfekte olmamış hücreleri içeren lamelleri PBS ile 5 kez yıkayın.
Daha sonra hücreleri %2 paraformaldehit ve PBS ile sabitleyin. 10 dakika sonra, lamelleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın ve ardından lamelleri 10 dakika boyunca iyonik olmayan deterjanla geçirgenleştirin.
Üç adet 5 dakikalık PBS yıkamasından sonra, lamelleri 30 dakika boyunca bloke edici solüsyon içinde inkübe edin, ardından bir fare monoklonal veya poliklonal antikoru ile 30 dakikalık bir inkübasyon daha yapın. Yıkamalardan sonra, lamelleri 30 dakika boyunca bloke edici solüsyonda ikincil antikor ve konak hücredeki aktin filamentlerini boyamak için falloidin ile inkübe edin.
Ardından, lamel yüzeyine az miktarda DAPI besiyeri ile solmaya karşı önleyici montaj reaktifi uygulamadan önce lamelleri PBS ile üç kez tekrar yıkayın. Forseps kullanarak, kabarcık oluşumunu önlemek için lameli ortamdaki yavaşça eğin.
Çift etiketleme için, lamelleri ve blokaj çözeltisini daha önce gösterildiği gibi inkübe ettikten sonra, bunları fare poliklonal antikorunda 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, lamelleri ikincil antikor ile 30 dakika inkübe etmeden önce her biri 5 dakika boyunca üç kez PBS ile yıkayın.
Ardından, üç PBS yıkamanın ardından, blokaj solüsyonu içinde seyreltilmiş AffiniPure tavşan fare önleyici IgG ile ikinci bir blokaj adımı gerçekleştirin. 30 dakika sonra, lamelleri fare monoklonal antikoru ile 30 dakika daha inkübe etmeden önce tekrar PBS ile yıkayın.
Daha sonra, üç PBS yıkamasından sonra, lamelleri keçi anti-fare IgG2b antikoru ve phalloidin ile inkübe edin. Ardından, üç PBS yıkamasından sonra, daha önce gösterildiği gibi solma önleyici montaj reaktifi uygulayın.
Bu çalışma, T. cruzi ile enfekte edilmiş epitel hücrelerde konakçı ve parazit proteinlerin lokalizasyonunu analiz etmek için kullanılan çift etiketli immünofloresan tekniğini detaylandırmaktadır. Yöntem, proteinleri konfokal mikroskop altında görüntülemek için çeşitli antikorlar ve floroforlar kullanmaktadır.
Çift etiketli immünofloresan yöntemle, enfekte hücreler içindeki hem konakçı hem de patojen proteinlerinin hassas bir şekilde görselleştirilmesi sağlanarak, bulaşıcı hastalık araştırmalarında mekanistik risk azaltma ve hedef doğrulaması süreçleri doğrudan desteklenir. Bu yetenek, konakçı-patojen biyolojisi için kritik olan uzaysal protein etkileşimlerini netleştirerek keşif aşamasındaki öngörü güvenini artırır. Yöntem, bulaşıcı ajanlara odaklanan biyofarma Ar-Ge çalışmalarında portföy seçimi ve erken aşama karar verme süreçleri için stratejik bir konumdadır.
Bu çift etiketli immünofloresan tekniği, mekanistik çalışmalar ile bulaşıcı hastalık araştırma hatlarındaki translasyonel araştırmalar arasında köprü kurarak, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürekliliğe entegre olur.
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026