Enfekte bir hücrede konakçı ve patojen proteinlerini görselleştirmek için çift etiketli bir immünofloresan tekniği

0 görüntüleme3:44 dk • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patojenik bir parazit ile enfekte olmuş sabit ve geçirgen epitel hücreleri ile başlayın.

Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir engelleme tamponu ekleyin.

Özellikle parazitin proteinleri ile etkileşime giren fare poliklonal birincil antikorları ile kaplama.

Parazitik proteine bağlı birincil antikorlarla etkileşime giren uzak kırmızı florofor işaretli ikincil antikorlar ekleyin.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın. Konak-protein etiketlemesi sırasında çapraz reaktiviteyi en aza indirerek, birincil antikorlara bağlanan anti-fare antikorları ile bloklayın.

Epitel hücreleri içinde konakçı ribonükleoproteinleri hedef alan fare monoklonal primer antikorları ekleyin.

Sırasıyla konakçı proteine bağlı primer antikorların ve aktinin etiketlenmesini kolaylaştıran, yeşil florofor etiketli ikincil antikorlar ve kırmızı florofor konjuge phalloidin karışımı ile kaplayın.

Bir tampon ile yıkayın. Konakçı çekirdeğe, parazit çekirdeğine ve kinetoplasta mavi bir renk veren DNA lekesi içeren bir ortam kullanarak monte edin.

Numuneleri konfokal bir mikroskop kullanarak analiz edin. Çift etiketli immünofloresan tekniği, yeşil konak proteinlerini ve kırmızı parazitik proteinleri göstererek bunların kesin hücre altı lokalizasyonunu sağlar.

LLC-MK2 hücrelerini, UV ile sterilize edilmiş yuvarlak lameller içeren 24 oyuklu plakalara ekleyin ve 16 saat boyunca oturmalarına izin verin. Daha sonra hücreleri enfekte etmek için, her bir oyuğa T. cruzi içeren süpernatan ekleyin ve altı saat inkübe edin. Daha sonra, enfekte olmuş ve enfekte olmamış hücreleri içeren lamelleri PBS ile 5 kez yıkayın.

Daha sonra hücreleri %2 paraformaldehit ve PBS ile sabitleyin. 10 dakika sonra, lamelleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın ve ardından lamelleri 10 dakika boyunca iyonik olmayan deterjanla geçirgenleştirin.

Üç adet 5 dakikalık PBS yıkamasından sonra, lamelleri 30 dakika boyunca bloke edici solüsyon içinde inkübe edin, ardından bir fare monoklonal veya poliklonal antikoru ile 30 dakikalık bir inkübasyon daha yapın. Yıkamalardan sonra, lamelleri 30 dakika boyunca bloke edici solüsyonda ikincil antikor ve konak hücredeki aktin filamentlerini boyamak için falloidin ile inkübe edin.

Ardından, lamel yüzeyine az miktarda DAPI besiyeri ile solmaya karşı önleyici montaj reaktifi uygulamadan önce lamelleri PBS ile üç kez tekrar yıkayın. Forseps kullanarak, kabarcık oluşumunu önlemek için lameli ortamdaki yavaşça eğin.

Çift etiketleme için, lamelleri ve blokaj çözeltisini daha önce gösterildiği gibi inkübe ettikten sonra, bunları fare poliklonal antikorunda 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, lamelleri ikincil antikor ile 30 dakika inkübe etmeden önce her biri 5 dakika boyunca üç kez PBS ile yıkayın.

Ardından, üç PBS yıkamanın ardından, blokaj solüsyonu içinde seyreltilmiş AffiniPure tavşan fare önleyici IgG ile ikinci bir blokaj adımı gerçekleştirin. 30 dakika sonra, lamelleri fare monoklonal antikoru ile 30 dakika daha inkübe etmeden önce tekrar PBS ile yıkayın.

Daha sonra, üç PBS yıkamasından sonra, lamelleri keçi anti-fare IgG2b antikoru ve phalloidin ile inkübe edin. Ardından, üç PBS yıkamasından sonra, daha önce gösterildiği gibi solma önleyici montaj reaktifi uygulayın.

09:16

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:18

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:05

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

İlgili videolar

0 Görüntüler

20:47

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:16

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi In situ Hibridizasyon (FISH)

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:19

Enfekte Hücrelerde Viral Protein Lokalizasyonu için Bir İmmünofloresan Tekniği

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:56

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:28

Hepatit C Virüsü Karşı İnsan laktoferrinin Hücresel Alımı ve İlişkili Antiviral Aktivite Monitör İmmünofloresan

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:40

Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:24

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 18 Temmuz 2026