Monoklonal Antikorların Saflaştırılması için Bir Afinite Kromatografisi Tekniği

Antikor bağlayıcı bir protein olan Protein A'ya konjuge edilmiş agaroz boncukları içeren bir afinite kromatografi sütunu alın.

Sütunu dengelemek için nötr pH'lı bir bağlayıcı tampon ekleyin.

Kültür süpernatanı, monoklonal antikorlar ve kontamine hücresel proteinler içeren antikor üreten bir hücre kültüründen yükleyin.

Nötr pH, kirleticiler akarken protein A'nın antikorların Fc bölgesine bağlanmasını kolaylaştırır.

Bir kromatogram oluşturmak için akışın UV emilimini ölçün. Numune yükleme sırasındaki yüksek absorbans, akıştaki bağlanmamış proteinleri gösterir.

Özel olarak bağlı olmayan kirleticileri çıkarmak için sütunu bağlayıcı tamponla yıkayın.

Protein A-antikor etkileşimini bozmak için düşük pH'lı bir elüsyon tamponu ekleyin. Absorbanstaki zirveyi izleyerek ayrıştırılan antikorları toplayın.

Antikor bozulmasını önlemek için pH'ı nötralize edin ve bir santrifüj filtreye aktarın.

Antikorları konsantre etmek için santrifüjleyin ve aşağı akış tahlilleri için bir tamponda yeniden süspanse edin.

Arabellekleri hazırladıktan ve FPLC sistemini metin protokolüne göre başlattıktan sonra, çalıştırma adımlarını aşağıdaki gibi ayarlamak için yöntem düzenleyicisini kullanın. Sistemi beş sütun hacmi veya CV bağlama arabelleği ile dengeleyin.

Numuneyi kolona yükleyin ve numune akışını toplayın ve ardından sistemi yıkamak için beş CV bağlayıcı tampon kullanın. İzokratik fraksiyonlama yoluyla sütunu elüte etmek için beş CV elüsyon tamponu kullanın. ve saflaştırılmış antikor örneklerini fraksiyon toplayıcıyı kullanarak fraksiyonlar halinde toplayın.

Son olarak, sistemi beş CV bağlayıcı tampon ile dengeleyin ve akışı bir atık kabına toplayın. Yöntem kurulumu tamamlandıktan sonra, sütuna uygulanacak koşullu ortamın hacmini belirtin ve yöntemi kaydedin.

Ardından, numune pompası hortumunu şartlandırılmış ortamı içeren kaba daldırın. Ardından, belirtilen çıkış borusu aracılığıyla numune akışını toplamak için ayrı bir kap hazırlayın. Toplama tüplerini fraksiyon toplayıcıya yerleştirin ve her toplama tüpüne nötralizasyon tamponu ekleyin. Yazılımın sistem kontrol modülünde, kullanılacak yöntemi açın. Ardından çalıştırmayı başlatmak için Başlat'a tıklayın.

Saflaştırma tamamlandığında ve değerlendirme modülü geldiğinde, elde edilen kromatogramı kontrol edin. Protein içeren tüm fraksiyonları bir tüpte birleştirin ve ardından numuneyi konsantre etmek ve tampon değişimini gerçekleştirmek için PBS ve 30 kilodaltonluk bir kesime sahip bir santrifüj filtre cihazı kullanın. Son olarak, antikor konsantrasyonunu üreticinin talimatlarına göre ölçmek için BCA testini kullanın.