Erişkin Hipokampal Nörojenezi Tespit Etmek için Bir İmmünofloresan Boyama Tekniği

Farklı farklılaşma aşamalarında nöronal progenitörlerden oluşan bir nörojenez bölgesi olan hipokampal dentat girustan oluşan bir murin beyin bölümünü ele alalım.

Kesiti geçirgenliği engelleyen bir çözeltiye aktarın. Çözeltideki deterjan molekülleri hücrelere nüfuz ederken, proteinler spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke eder.

Spesifik nörojenez belirteçlerini, mikrotübül ile ilişkili bir proteini ve bir ara filament proteinini hedefleyen bir birincil antikor kokteyli ekleyin.

Bağlanmamış antikorları çıkarın. Primer antikorlara bağlanan farklı florofor etiketli sekonder antikorları tanıtın.

Birincil antikorlardan biriyle aynı konakçıdan serum proteinleri ekleyin ve ikincil antikorlar üzerindeki paratopları doyurun.

Serum proteinlerinin epitoplarını doyuran ve spesifik olmayan bağlanmayı önleyen monovalent Fab fragmanlarını tanıtın.

Başka bir ara filament proteinine bağlanan, aynı konak tarafından yükseltilen ikinci bir primer antikor ekleyin.

İkinci primer antikoru hedef alan florofor işaretli sekonder antikorları tanıtın.

Floresan mikroskobu kullanarak, benzersiz belirteç kombinasyonlarını ifade eden nöronal progenitör alt tiplerini tanımlayın.

Antifriz çözeltisinden bölümlerin ince bir fırça yardımıyla TBS'ye aktarılmasıyla başlayın. Bölümleri iyice durulayın, 4 santigrat derecede bir gece yıkamaya başlayın, ardından oda sıcaklığında 10 dakikalık beş yıkamaya devam edin. Tüm bu inkübasyonlar sürekli hafif ajitasyon ile yapılmalıdır.

İlgilenilen antijenlerden biri bir timidin analoğu ise, bu noktada bir hidroklorik asit denatürasyon aşaması uygulanmalı, ardından borat tamponunda bir nötralizasyon aşaması uygulanmalıdır. TBS-plus'ta spesifik olmayan antikor bağlama bölgelerinin geçirgenliği ve bloke edilmesi ile devam edin. Bu inkübasyonu oda sıcaklığında 1 saat bekletin.

Daha sonra, TBS-plus'ta gece boyunca 4 santigrat derecede seyreltilmiş ilk birincil antikorda inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri TBS'de üç kez ve TBS-T'de bir kez yıkayın. Her banyonun 10 dakika gitmesine izin verin. Daha sonra, ilk florokrom konjuge ikincil antikorda oda sıcaklığında üç saat inkübe edin. Şu andan itibaren, bölümleri ışığa maruz kalmaktan koruyun.

Başka bir yıkama serisinden sonra, bölümleri, iki birincil antikorun yapıldığı %10'luk bir konakçı tür serum çözeltisine aktarın. Birinci ikincil antikor üzerindeki açık paratopları doyurmak için bu çözeltideki bölümleri üç saat inkübe edin. Daha sonra, serumu çıkarmak için TBS'de üç kez ve TBS-T'de bir kez durulayın.

Daha sonra, birincil antikorun konakçı türüne karşı yönlendirilmiş mililitre başına 50 mikrogram konjuge olmayan monovalent Fab fragmanı içeren bir TBS-plus çözeltisi hazırlayın. Bu, aksi takdirde ikinci ikincil antikor tarafından tanınabilecek epitopları kapsar. Bölümleri bu çözeltiye aktarın ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, bölümleri TBS'de en az üç kez ve TBS-T'de bir kez durulayın. Transferler sırasında, kalan Fab kalıntılarını çıkarmak için bölümleri içeren ağ eklerini bir kağıt havlu üzerine sürün. Şimdi, ikinci primer antikordaki bölümleri gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Başka bir yıkama serisinden sonra, ikinci ikincil antikoru oda sıcaklığında üç saat boyunca uygulayın. Son olarak, bölümleri TBS'de üç kez yıkayın ve bölümleri jelatin içine monte etmeye devam edin. Slaytları havayla kurutun ve solmaya karşı dayanıklı bir montaj ortamı kullanarak lamel yapın.