Proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görselleştirmek için bir immünoetiketleme tekniği

Doku yapısını stabilize eden bir sodyum kakodilat tamponunda sabit bir kalp bölümünü yıkayarak başlayın. Membran lipitlerini lekelemek için bölümü osmiyum tetraoksit içine daldırın.

Boyama için optimum pH'ı korumak için sodyum asetat ile muamele edin.

Mikroskopi sırasında daha iyi kontrast sağlayan biyomolekülleri boyamak için uranil asetat ekleyin.

Dokuyu artan etanol konsantrasyonlarında ve ardından asetonla kurutun.

Dokuyu bir reçineye gömün, ultra ince kesitler elde edin ve bunları bir mikroskopi ızgarasına aktarın.

Hücresel proteinin maskesini kaldırarak osmiyum tetraoksiti çıkarmak için sodyum meta-periyodat ekleyin.

Bileşik ayrıca glikoproteini oksitleyerek glisin muamelesi ile nötralize edilen reaktif aldehit grupları oluşturur.

Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önleyen bir bloke edici tampon ekleyin.

Hedef proteine özgü birincil antikorları ve ardından biyotinile edilmiş ikincil antikorları ekleyin.

Biotin'e bağlanan streptavidin konjuge kuantum noktaları ekleyin.

Bir elektron mikroskobu altında, kuantum nokta etiketli bölgeler daha yüksek kontrast sergiler ve hedef proteinin hassas hücre altı lokalizasyonuna yardımcı olur.

24 saatlik fiksasyondan sonra, dokuyu 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda 20 dakika boyunca iki kez yıkayın. Dokuyu sodyum kakodilat tamponundan çıkarın ve oda sıcaklığında 4 saat boyunca% 2 osmiyum tetroksit çözeltisine daldırın.

Osmikasyondan sonra, dokuyu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 2 sodyum asetat çözeltisine daldırın. Daha sonra, dokuyu oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 2 uranil asetat çözeltisine daldırın. Uranil asetat boyamadan sonra, dokuyu dereceli alkoller ve aseton yoluyla sırayla kurutun.

Susuz kalmış dokuyu, el yazmasında anlatıldığı gibi düşük viskoziteli epoksi reçineye gömün. Dokuyu 8 milimetrelik mikro kalıplarda, kalıplarda taze reçineye koyun ve gömülü dokuyu gece boyunca 70 santigrat derecede sertleştirin. Ultra 45 derecelik bir bıçak kullanarak ilgi alanını bulduktan sonra, soluk altın ultra ince bölümler üretin. Bu ultra ince bölümleri 200 gözenekli bir bakır ızgaranın donuk tarafına yerleştirin.

Temiz bir parafin film üzerine 20 mikrolitre aşındırma solüsyonu sodyum metaperiodat koyarak antijenin maskesini kaldırarak boyamaya başlayın. Kurutulmuş ızgarayı, doku kesitleri ile aşındırma çözeltisinin damlacığı üzerine yerleştirin. Kesit ızgarasını çözelti üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Kazınmış doku bölümlerini 60 saniye boyunca bir damla damıtılmış su üzerine koyarak yıkayın.

Kesit ızgarasını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0.05 molar glisin çözeltisi damlacığı üzerine yerleştirerek kalan aldehitleri bloke edin. Kalan glisin çözeltisini çıkarmak için ızgaranın kenarlarını filtre kağıdına kurulayın. Kesit ızgarasını oda sıcaklığında 25 dakika boyunca 10 ila 20 mikrolitre engelleme çözeltisine yerleştirin.

Izgara kenarlarını filtre kağıdına kurulayın ve ızgara bölümlerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca şartlandırmak için antikor seyrelticisine yerleştirin. Izgara bölümlerini birincil antikor ile nemlendirilmiş bir odada 1 saat 30 dakika inkübe edin. Izgarayı kurulayın ve ızgara bölümlerini her biri 5 dakika boyunca iki kez antikor seyreltici ile yıkayın.

Izgara bölümlerini nemlendirilmiş bir odada 1 saat boyunca biyotinile edilmiş ikincil antikor ile inkübe edin. Izgara kuruduktan sonra, ızgara bölümlerini her biri 5 dakika boyunca iki kez antikor seyreltici ile yıkayın. Izgara bölümlerini, ticari olarak temin edilebilen streptavidin konjuge QD'de oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 1 saat inkübe edin. Hazneyi alüminyum folyo ile kaplayarak ışığa maruz kalmayı önleyin. Izgara kenarlarını filtre kağıdı kullanarak kuruttuktan sonra, ızgara bölümlerini iki dakika boyunca su damlacıklarının üzerine koyarak yıkayın ve kuruması için ızgara kenarlarını kurulayın.