Böbreğin üç boyutlu görüntülenmesi için tam montajlı organ boyama tekniği

Sabit bir fare böbreği alın. Dokudaki lipitler ışık saçılımına neden olur ve pigmentler ışık emilimine neden olarak hücreleri opak hale getirir.

Delipidasyon ve renk giderme için dokuyu CUBIC-L ile tedavi edin. CUBIC-L'deki amino alkol, lipitleri ve pigmentleri uzaklaştırarak ışık saçılmasını en aza indirir ve şeffaflığı artırır.

CUBIC-L'deki deterjan molekülleri de hücrelere nüfuz eder.

Sempatik sinirlerin nöronlarındaki sitoplazmik tirozin hidroksilaza ve damar düz kas hücrelerindeki alfa-düz kas aktinine bağlanan bir birincil antikor kokteyli tanıtın.

Birincil antikorlara bağlanan florofor işaretli ikincil antikorlar ekleyin.

Antikor tedavisini korumak için doku postfiksasyonu gerçekleştirin.

Dokuyu suyun yerini alan ve proteinlerin kırılma indisiyle eşleşen, ışık saçılmasını daha da en aza indiren ve şeffaflığı artıran CUBIC-R+'ya daldırın.

Işık tabakası floresan mikroskobu altında, ışık tabakaları dokuyu aydınlatır ve floroforları heyecanlandırır.

Floroforun yaydığı ışığı yakalayın ve böbrekteki atardamarların etrafındaki sempatik sinir dağılımını gösteren üç boyutlu bir görüntü oluşturun.

Başlamak için, perfüzyon fiksasyonundan ve böbrek örneklemesinden hemen sonra böbreği 16 saat boyunca 4 santigrat derecede %4 paraformaldehite daldırarak daldırma fiksasyonunu gerçekleştirin. Her biri iki saat boyunca PBS kullanarak üç yıkama yapın. Sabit böbreği yedi mililitrelik %50 CUBIC-L'ye 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak daldırarak renk giderme ve delipidasyon işlemini gerçekleştirin.

Altı saat sonra, böbreği beş gün boyunca 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayarak 14 milimetrelik yuvarlak tabanlı bir tüpte yedi mililitre CUBIC-L'ye daldırın. CUBIC-L'yi her gün yenileyin. Renk giderme ve delipidasyon tamamlandıktan sonra, numune işleme için bir dağıtım kaşığı kullanın ve böbreği iki saat boyunca oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın.

Boyama tampon çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikorlardaki delipide edilmiş böbreği yedi gün boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatör çalkalayıcıda hafifçe çalkalayarak immün boyayın. Daha sonra böbreği PBS olarak da bilinen PBS'de% 0.5 Triton X-100 ile bir gün oda sıcaklığında yıkayın. İkincil antikor boyaması için, böbreği karanlıkta boyama tamponunda ikincil antikorlarla tedavi edin ve yedi gün boyunca 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayın. Lekeyi bir gün boyunca oda sıcaklığında bir PBST yıkama ile düzeltin.

Fiksasyon sonrası, böbreği üç saat boyunca PB'de% 1 formaldehit içine daldırın ve altı saat boyunca oda sıcaklığında PBS ile yıkayın. Böbreği yedi mililitre% 50 CUBIC-R + içine 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe bir gün çalkalanarak kırılma indisi eşleştirmesini gerçekleştirin, ardından iki gün boyunca oda sıcaklığında çalkalayarak yedi mililitre CUBIC-R + ile tedavi edin.