Deri Biyopsi Bölümünde Alfa-sinüklein Agregatlarını Tespit Etmek için Bir İmmünofloresan Testi

Bir Parkinson hastalığı hastasından alınan bir deri biyopsisinin kriyokesitini gömülü bir ortamda alın.

Doku, en dışta bir epidermis, altta yatan bir dermis ve sinirler tarafından innerve edilen deri altı yağdan oluşur.

Gömme ortamını çıkarmak için bölümü yıkayın. Hücrelere nüfuz ederek ve spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke ederek geçirgenleştirme engelleme çözeltisine aktarın.

Serbest yüzen boyama olarak adlandırılan tek tip antikor etiketlemesi elde etmek için bölümü bir birincil antikor kokteyline daldırın.

Antikorlar nöronlara girer ve aksonlar boyunca dağıtılan alfa-sinüklein agregatlarına (nörodejeneratif hastalıkların karakteristik bir toplu formu) ve karboksil-terminal hidrolazlara bağlanır.

Primer antikorlara bağlanan florofor konjuge ikincil antikorları tanıtın.

Çekirdeği lekeleyen bir floresan DNA bağlayıcı boya ile muamele edin.

Dokuyu bir slayt üzerine yerleştirin, bir montaj ortamı uygulayın ve bir lamel ile kapatın.

Konfokal bir mikroskop altında, her iki antikordan gelen floresan, dermal nöronların aksonları boyunca alfa-sinüklein agregatlarının varlığını ortaya çıkarır.

Başlamak için, 96 oyuklu yeni bir plakanın bazı kuyularını 100 mikrolitre yıkama solüsyonu ile doldurun. Analiz edilecek bölümleri saklama plakasından yıkama solüsyonunu içeren plakaya aktarın. Bölümleri oda sıcaklığında 10 dakika yıkama solüsyonunda bırakın. Ardından, her bölümü aynı yıkama solüsyonunu içeren boş bir kuyuya aktarın ve yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra, bölümlere bir yıkama çözeltisi ekleyin ve bunları 100 mikrolitre engelleme çözeltisi içeren yeni kuyucuklara aktarın. Oda sıcaklığında en az 90 dakika ve en fazla 4 saat inkübe edin.

Çalışma solüsyonundaki birincil antikorları, anti-PGP9.5 ve anti-5G4'ü seyreltin. Bölümleri, birincil antikorların çalışma çözeltisinden 100 mikrolitre içeren yeni oyuklara aktarın ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

Ertesi gün, bölümleri daha önce tarif edildiği gibi yıkama solüsyonu içeren kuyularda yıkayın. İkincil antikorları seyreltin - çalışma solüsyonunda 5G4'ü tespit etmek için anti-PGP9.5'i tespit etmek için keçi anti-tavşan ve keçi anti-fare.

Yıkanmış bölümleri, ikincil antikorların çalışma çözeltisinin 100 mikrolitresini içeren yeni kuyucuklara aktarın. İkincil antikorlarla konjuge edilmiş floroforun ağartılmasını önlemek için plakayı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin.

Bundan sonra, bölümleri daha önce tarif edildiği gibi yıkama solüsyonunda iki kez yıkayın. Yıkanan bölümleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 mikrolitre DAPI içeren yeni kuyucuklara aktarın. Bölümleri daha önce tarif edildiği gibi yıkama solüsyonunda iki kez yıkayın. Ardından, yanlış katlamayı önleyerek bölümleri doğru konumda bir kızağa monte edin.

Sürgüye birkaç damla montaj ortamı ekleyin ve bölümü bir lamel ile örtün. Slaytları gece boyunca kurumaya bırakın. Ertesi gün, slaytları 4 santigrat derecede uygun bir kutuda saklayın ve ışığa maruz kalmamaya dikkat edin.

Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu veya konfokal mikroskop kullanarak bölümleri görüntüleyin. Görüntüleri mikroskoba bağlı bir kamera ile elde edin. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi, kesitlerdeki pozitif sinyalleri, sinyalin uzamsal dağılımı ve yoğunluğu açısından analiz etmek için bir floresan mikroskobu veya konfokal mikroskop kullanın.