JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 4:57 dk. • July 8th, 2025
Dizi blokları halinde düzenlenmiş basılı glikan alt dizileri içeren işlevselleştirilmiş bir glikoçip ile başlayın.
Alt dizideki her nokta, monosakkarit bileşimi, zincir uzunluğu ve dallanma modelinde varyasyonlara sahip karbonhidrat bazlı bir polimer olan farklı bir glikanı temsil eder.
Spesifik olmayan etkileşim bölgelerini bloke etmek için glikoçipi bir bloke edici tampon ile muamele edin.
Glikoçipi aktarın ve antikor agregasyonunu en aza indirmek için seyreltilmiş fare serumunu yüzey aktif madde takviyeli bir tampona ekleyin. Ajitasyon altında inkübe edin.
Ajitasyon, anti-glikan antikorlarının farklı moleküler özelliklere dayalı olarak spesifik glikanlara seçici bağlanmasını kolaylaştırarak üniform serum dağılımını teşvik eder.
Spesifik olmayan bağlanmayı bozmak için yüzey aktif madde içeren bir tamponun azalan konsantrasyonlarında yıkayın ve durulayın.
Glikoçipi, önceden bağlanmış anti-glikan antikorları ile etkileşime girerek, anti-fare biyotini ile konjuge ikincil antikorlarla kaplayın ve yıkayın.
Biyotinile edilmiş ikincil antikorlara bağlanan florofor etiketli streptavidin ekleyin. Fazla çözeltiyi yıkayın ve çıkarın.
Glikoçipi tarayın ve serumda glikana özgü dolaşımdaki antikorları düşündüren çeşitli pozisyonlarda farklı floresan noktaları olup olmadığını gözlemleyin.
Tampon #1'i metin protokolünde açıklandığı gibi tampon #4 ile hazırlayın. Glikoçipleri ve numuneleri hazırlamak için, slaytlarla birlikte saklama kutusunu oda sıcaklığına ulaşana kadar masanın üzerine koyun. Kutuyu açın ve glikoçipi, hazne içindeki nemi sabit tutmak için ıslak filtre kağıdı ile şartlandırılması gereken inkübasyon odasına aktarın.
Bu arada, fare serumunu 1.5 mililitrelik tüplerde tampon 1 ile seyreltin. Serum solüsyonunu bir vorteks karıştırıcı ile 5 saniye boyunca homojenize edin. Homojenizasyondan sonra, immünoglobulin agregasyonunu önlemek için seyreltilmiş serumu 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin. Daha sonra tüpleri 10.000 kez g ve 25 santigrat derecede 3 dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı toplayın ve çökelmiş malzemeleri atın. Glikoçipi dikkatlice inkübasyon odasına yerleştirin. Glikoçipin yüzeyindeki herhangi bir kalıntı materyali ortadan kaldırmak için 1 mililitre tampon #3 ile inkübe edin. 15 dakika boyunca, 25 santigrat derecede, glikobiti dikey konumda tutun ve plastik bir Pasteur pipeti kullanarak birkaç damla tampon #3 ile tekrar yıkayın.
Ardından, filtre kağıdı kullanarak tamponu glikofit yüzeyinden dikkatlice çıkarın. Glikoçipi tekrar inkübasyon odasına yerleştirin. Seyreltilmiş serum örneğini bir mikropipet kullanarak glikokip yüzeyine yayın. Glikoçip yüzeyinin tüm kuru alanlarının, pipetin ucunu kullanarak seyreltilmiş serum örneği ile kaplandığından emin olun.
1 ve 1/2 saat boyunca 37 santigrat derecede orbital ajitasyon ile inkübe edin. İnkübasyonun ardından, fazla numuneyi çıkarın ve glikoçipi 5 dakika boyunca 25 santigrat derecede tampon #3'e daldırın. Glikoçipi tampon #4 içeren bir kaba geçirin ve son olarak glikopili ultra saf suyla yıkayın.
Sıvıyı çıkarmak için glikoçipi 175 kez g ve 25 santigrat derecede 1 dakika santrifüjleyin. Glikoçipi tekrar inkübasyon odasına yerleştirdikten sonra, glikofit yüzeyine biyotin ile konjuge edilmiş bir keçi anti-fare çözeltisi yayın. Bir saat boyunca 37 santigrat derecede orbital ajitasyon ile inkübe edin. Bağlanmamış fraksiyonu çıkarın ve yıkama adımlarını tekrarlayın.
Santrifüjlemeyi takiben, glikoçipi karanlıkta 25 santigrat derecede 45 dakika boyunca, tampon #2'de karşılık gelen florokrom etiketli streptavidin çözeltisinin mililitresinde 2 mikrogram ile inkübe edin. Bağlanmamış fraksiyonu çıkarmak için karanlıkta çalıştıktan ve yıkama adımlarını tekrarladıktan sonra, glikokiti hava ile kurutun.
Diziyi taramak için, karanlıkta oda sıcaklığına ulaşana kadar glikoçipi masanın üzerinde bırakın. Aynı zamanda, slayt tarayıcıyı ve lazeri açın. Mikrodiziyi tutarak, glikoçipi arkaya değene kadar yuvaya kaydırın. Kolay Tarama'yı çalıştırarak glikoçipi tarayın ve taramayı .tiff dosyası olarak kaydedin.