Bitki dokusunda Arabinogalaktan proteinlerinin ve pektinlerin immünolokalizasyonu

Farklı bitki dokularının ince kesitlerini içeren reaksiyon kuyuları ile bir slayt alın. Dokular sabitlenir ve immün boyama için bir reçine içine gömülür.

Sonraki adımlarda ışığa maruz kalmayı ve reaktif buharlaşmasını önlemek için slaytı karanlık ve nemli bir inkübasyon odasına yerleştirin.

Spesifik olmayan antikor etkileşimini önlemek için bir bloke edici çözelti tanıtın.

Fazla bloke edici solüsyonu çıkarmak için yıkayın, ardından antijene özgü primer antikorları ekleyin ve inkübe edin.

Antikorlar, hedef antijenlerine, yani hücre duvarındaki arabinogalaktan proteinlerine ve pektinlere bağlanır.

Primer antikorlara bağlanan florofor konjuge ikincil antikorları tanıtın.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın ve selüloza bağlanan ve hücre duvarını etiketleyen bir floresan boya uygulayın.

Bir montaj ortamı ekleyin ve bir lamel ile kapatın.

Mikroskop altında, boyadan ve bağlı antikorlardan gelen floresan, arabinogalaktan proteinleri veya pektin ile kolokalize edilmiş bitki hücre duvarlarındaki selülozun görselleştirilmesine yardımcı olur ve dokuya özgü dağılımlarını sergiler.

Reaksiyon slaytları için bir inkübasyon odası hazırlamak için, pipet ucu kutusunun altına biraz nemli kağıt havlu yerleştirin ve kutuyu alüminyum folyo ile sarın. Slaytları kutudan inkübasyon odasına aktarın. Her kuyucuğa 50 mikrolitre engelleme solüsyonu pipetleyin. Slaytı 10 dakika inkübe ettikten sonra, bloke edici çözeltiyi çıkarın. Ardından, tüm kuyucukları her seferinde 10 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın. Makalede tarif edildiği gibi birincil antikor çözeltilerini hazırladıktan sonra, kuyucukları 5 dakika boyunca damıtılmış, deiyonize su ile son bir yıkama yapın.

Birincil antikor çözeltisini reaksiyon kuyucuklarına pipetleyin. Ardından, engelleme solüsyonunu kontrol kuyularına pipetleyin. Kuluçka odasını kapatın. Oda sıcaklığında iki saat bekletin ve ardından gece boyunca 4 santigrat derecede soğutun. Bloke edici çözeltide ikincil antikorun% 1'lik bir çözelti hazırlayın. Kuyu başına yaklaşık 40 mikrolitreye ihtiyaç duyulacaktır.

Çözeltiyi alüminyum folyo ile örtün. Reaksiyon slaytının kuyularını iki kez PBS ile ve bir kez damıtılmış, deiyonize su ile her seferinde 10 dakika yıkayın. Kuyularda herhangi bir engelleme çözeltisi veya tortu kalmadığından emin olun. İkincil antikor çözeltisini tüm kuyucuklara pipetleyin. Slaytları karanlıkta oda sıcaklığında 3 ila 4 saat inkübe edin.

Yine, reaksiyon slaytının kuyularını iki kez PBS ile ve bir kez damıtılmış, deiyonize su ile yıkayın. Sonra her kuyucuğa bir damla calcofluor-white ekleyin. Yıkamadan, her kuyucuğa bir damla montaj ortamı ekleyin ve her kuyuyu bir lamel ile örtün. Bir floresan mikroskobu kullanarak reaksiyon slaytındaki numune bölümlerini gözlemleyin.

Her gözlem için, kalkoflor tarafından lekelenen hücre duvarlarını tespit etmek için bir UV filtresi ve immünolokalizasyonu tespit etmek için bir FITC filtresi kullanın. Sonuçların daha iyi görselleştirilmesi için, her UV filtre görüntüsünü karşılık gelen FITC filtre görüntüsüyle birleştirmek için ImageJ veya benzer bir görüntü analiz programı kullanın.