Bir aşıdaki immünojenik glikoprotein içeriğini belirlemek için bir sandviç ELISA kullanmak

Spesifik olmayan etkileşimleri önlemek için kuduz immünojenik glikoproteine özgü monoklonal antikorlar ve bir bloke edici ajan ile kaplanmış pasifleştirilmiş bir test plakası ile başlayın.

Seri olarak seyreltilmiş referans ve azalan glikoprotein içeriğine sahip kuduz aşılarını test edin. Kirlenmeyi önlemek için plakayı kapatın.

İnkübasyon sırasında, immünojenik glikoproteinler, spesifik bir antijenik bölge yoluyla kaplanmış monoklonal antikorlarla etkileşime girer.

Kuluçka sonrası, filmi çıkarın, süpernatanı aspire edin ve plakayı yıkayın.

Glikoprotein üzerindeki farklı bir antijenik bölgeye bağlanan ve bir immünokompleks oluşturan enzim konjuge glikoproteine özgü monoklonal antikorlarla kaplama.

Bir substrat ve bir kromojen içeren bir çözelti ekleyin. Substrat enzim ile etkileşime girdiğinde, çözelti rengini değiştirerek kromojenin oksidasyonuna neden olur.

Enzimleri etkisiz hale getirmek için durdurucu bir çözelti ekleyin.

Absorbansı ölçün ve referans aşı değerlerini kullanarak bir referans eğrisi oluşturun.

Absorbans ile referans aşı dilüsyonlarının glikoprotein içeriği arasında doğrusal bir ilişkinin olduğu bölgeyi belirleyin. Ardından, bu bölgeye giren absorbansa dayalı olarak test aşısı seyreltmelerinin glipoprotein içeriğini tahmin edin.

Bıçağı yıkamak için, her kuyucuğa 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Daha sonra, dikkatlice aspire edin ve kuyu içeriğini% 2.6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın. Hassaslaştırılmış plakayı kapsamlı bir şekilde yıkamak için bu yıkama işlemini beş kez daha tekrarlayın.

Bundan sonra, mikroplakayı ters çevirin ve bir dakika boyunca oda sıcaklığında bir parça emici kağıt üzerinde kurumaya bırakın. Referans aşıyı, kuduz virüsü glikoproteininin nihai konsantrasyonu mililitre başına 10 mikrogram olacak şekilde bir mililitre damıtılmış su içinde sulandırın. Mililitre başına bir mikrogramlık bir kuduz virüsü glikoprotein konsantrasyonuna ulaşmak için seyrelticide sulandırılmış referans aşının 10 kat seyreltmesini hazırlayın.

Daha sonra, metin protokolünün birinci tablosunda belirtildiği gibi seyrelticide bu referans aşının altı seri iki kat seyreltmesini gerçekleştirin. Boş bir kontrol görevi görmesi için 200 mikrolitre seyrelticiyi çift kuyucuklara ve her bir referans aşı seyreltmesi için kuyu başına 200 mikrolitreyi çift olarak dağıtın.

Daha sonra, seyrelticide test edilen aşının 10 kat seyreltmesini hazırlayın ve metin protokolünün ikinci tablosunda belirtildiği gibi seyreltici içinde test edilen aşının yedi adet iki kat seri seyreltmesini hazırlayın. Test edilen her aşı seyreltmesinden 200 mikrolitreyi, mikroplakanın her bir oyuğuna iki kopya halinde dağıtın. Mikroplakayı yapışkan film ile örtün ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Bundan sonra, filmi çıkarın, dikkatlice aspire edin ve her bir oyuğun içeriğini% 2.7'lik bir sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın. Plakayı yıkamak için, her kuyucuğa 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Dikkatlice aspire edin ve her bir oyuğun içeriğini% 2.6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.

Bağlanmamış antijeni çıkarmak için yıkama işlemini beş kez daha tekrarlayın. ve kaplanmış antikora bağlı G-protein trimerlerini koruyun. Yıkanmış mikroplakayı ters çevirin ve oda sıcaklığında bir parça emici kağıt üzerinde bir dakika kurumaya bırakın. Daha sonra, her bir oyuğa seyreltici içinde peroksidaz etiketli D1 monoklonal antikorun önerilen seyreltilmesinden 200 mikrolitre dağıtın.

Mikroplakayı yapışkan film ile örtün ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra, filmi çıkarın, dikkatlice aspire edin ve her bir oyuğun içeriğini% 2.6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın. Mikroplakayı yıkamak için, her bir kuyucuğa 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin.

Dikkatlice aspire edin ve her bir oyuğun içeriğini% 2.6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın. Bağlanmamış peroksidaz işaretli antikoru çıkarmak için bu yıkama işlemini beş kez daha tekrarlayın. Yıkama mikroplakasını ters çevirin ve oda sıcaklığında bir parça emici kağıt üzerinde bir dakika kurumaya bırakın.

Daha sonra, her bir kuyucuğa 200 mikrolitre substrat kromojen çözeltisi dağıtın. Mikroplakayı filmle kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, reaksiyonu durdurmak için her bir oyuğa 50 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin.

Mikro bıçağın altını dikkatlice silin ve bir spektrofotometreye yerleştirin. Kullanılan tüm kuyular için 492 nanometrede optik yoğunluğu belirleyin. Bu verileri analiz için bir elektronik tablo dosyasında toplayın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi hem referans aşı eğrisi hem de optik yoğunluk değerleri için grafikler oluşturun.