JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:39 dk • July 8th, 2025
Doğal hücre dışı matris ortamını taklit eden bir hidrojel sisteminde kapsüllenmiş memeli hücreleri içeren çok kuyulu bir plaka alın.
Kültür ortamını çıkarın. Hücresel bütünlüğü koruyarak proteinleri çapraz bağlamak için bir fiksasyon tamponu ile muamele edin.
Hücresel zarı geçirgen hale getirmek için deterjan içeren bir çözelti ekleyin.
Sonraki adımlarda spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir bloke edici çözelti tanıtın.
Hücrelere giren ve spesifik olarak sitoplazmik ara filamentlere ve hedef transkripsiyon faktörüne bağlanan bir birincil antikor kokteyli ekleyin.
Bağlanmamış antikorları çıkarın. DNA'yı floresan olarak etiketlemek için floresan etiketli ikincil antikorlar ve bir nükleer leke ekleyin.
Bağlanmamış molekülleri çıkarın.
Hidrojel kültürünü bir montaj ortamı kullanarak bir kızak üzerine monte edin.
İmmün lekeli hücreleri gözlemlemek için konfokal bir mikroskop kullanın.
İlk olarak, ortamı her bir kuyucuktan aspire edin. Ardından, kuyuları 1 mililitre ılık DPBS ile yıkayın. Yıkama tamamlandıktan sonra, her kuyucuğa 750 mikrolitre sabitleme çözeltisi ekleyin. Ardından, 24 oyuklu plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, sabitleme çözeltisini her bir kuyucuktan aspire edin ve sabitleyiciyi tehlikeli bir atık kabına atın. Ardından, numuneye 1 mililitre DPBS ekleyin ve DPBS'yi hemen tehlikeli bir atık kabına atın.
Daha sonra, numuneyi külbütör üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca dakikada 15 devirde geçirgen hale getirmek için 750 mikrolitre geçirgenleştirme çözeltisi ekleyin. Bir saat sonra, geçirgenlik çözeltisini aspire edin ve numuneye 750 mikrolitre bloke edici çözelti ekleyin. Numuneyi üç saat boyunca oda sıcaklığında külbütör üzerinde bırakın. Daha sonra, istenen birincil antikorları antikor seyreltme çözeltisi ile seyreltin.
Daha sonra, her numuneye 500 mikrolitre antikor çözeltisi ekleyin. Numuneleri gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini aspire edin. Ardından, numuneleri oda sıcaklığında dakikada 15 devirde üç kez bir saat PBST ile yıkayın.
Daha sonra, mililitre başına 2.5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için uygun ikincil antikorları ve 5 mg / ml DAPI stok çözeltisini seyreltin. Ardından, her numuneye 500 mikrolitre çözelti ekleyin. Ardından, 24 oyuklu plakayı kaplamak için alüminyum folyo kullanın ve plakayı gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, ikincil antikor çözeltisini aspire edin ve numuneleri PBST ile üç kez, her biri 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde yıkayın. Ardından, bir cam sürgünün yüzeyine bir damla sert ayarlanmış montaj ortamı yerleştirin ve numuneyi montaj ortamına yerleştirin. Son olarak, kontaminasyonu veya numune hareketini önlemek için numuneleri cam kapak sürgüsüne kapatmak için oje kullanın.