Virüs Kaynaklı Peptit Modifiye Antikor Konjugatlarının Hücre İçi Dağılımının Değerlendirilmesi

Yapışmış insan eritroblast hücreleri ile başlayın.

Virüs türevi, peptit ile modifiye edilmiş antikor konjugatlarını tanıtın. Bu konjugatlar, virüsten bir nükleer lokalizasyon dizisi veya NLS ve bir kolik asit kalıntısı içerir.

İnkübasyon sırasında, antikor konjugatları hücre yüzeyi reseptörleri ile etkileşime girer ve endozomlar içinde içselleştirilir.

Konjugattaki kolik asit, endozomal bölmeden kaçmaya yardımcı olarak hücre içi birikimi sağlarken, taşıma proteinleri ve NLS nükleer lokalizasyonlarını kolaylaştırır.

Hücreleri ayırmak ve yüzeye bağlı konjugatları çıkarmak için tripsin ve EDTA içeren tamponu ekleyin.

Tripsin aktivitesini inhibe etmek için serumla zenginleştirilmiş ortam ekleyin.

Hücreleri toplamak için santrifüjleyin; onları sabitleyin ve geçirgenleştirin.

Lokalize konjugatlara bağlanan uzak kırmızı florofor işaretli ikincil antikorları tanıtın ve yıkayın.

Nükleer boyama boyası ile tedavi edin.

Konfokal mikroskop altında gözlemleyin ve çeşitli düzlemsel derinliklerde görüntüler yakalayın.

Görüntü işlemeden sonra hücre, sitoplazma ve çekirdek içinde küçük yeşil floresan odaklar gösterir ve antikor konjugatlarının hücre içi dağılımını doğrular.

Hedef TF-1a hücrelerini 200 nanomolar 7G3-kolik asit-antikor konjugatı ile tedavi edin. Modifiye edilmiş kontrol monoklonal antikorları ile tedavi edilen hücreleri içerir. 5 x 10⁶ antijen pozitif hücreyi konjugatlarla 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Sonra süpernatanı çıkarın ve hücreleri üç kez yıkamak için bir mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın.

Taze ortam ekleyin ve hücreleri bir saat daha 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra,% 0.25 tripsin ve EDTA içeren 0.5 mililitre PBS ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede 30 dakikaya kadar inkübe edin. Ardından, tripsini nötralize etmek için% 10 FBS ile 1,5 mililitre RPMI-1640 ortamı kullanın.

Hücreleri beş dakika boyunca 500 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri tekrar üç kez yıkamak için 0,5 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın. Hücrelere PBS'de 0,5 mililitre %1 PFA ve %1 sükroz ekleyin ve sabitlemek için 30 dakika buza koyun.

Daha sonra hücreleri üç kez yıkamak için 0,5 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın ve numuneleri beş dakika boyunca 250 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, hücrelere PBS'de% 0.15 Triton X-100 ekleyin ve beş dakika boyunca buz üzerinde geçirgen hale getirin. Daha sonra buz gibi PBS ile hücreleri yıkayın ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın.

Hücreleri, AlexaFluor 647'ye konjuge edilmiş bir anti-murin Fc ikincil poliklonal antikorun mililitresinde iki mikrogram içeren 0.1 mililitre PBS'de askıya alın ve örnekleri karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Hücreleri beş dakika boyunca 250 kez g'de santrifüjleyin ve hücreleri üç kez yıkamak için 0,5 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın.

Daha sonra hücreleri 0.5 mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Hücrelere mililitre propidyum iyodür başına 10 mikrogram ekleyin. Ardından, numuneyi bir cam lamel ile kaplamadan önce 1 x 10⁵ hücreyi cam slaytlara monte etmek için montaj ortamını kullanın. Hücreleri, ters çevrilmiş lazer taramalı konfokal mikroskopta Plan Apo 60X yağa daldırma objektifi, sayısal açıklık 1.42 ile inceleyin.

488 nanometre argon lazeri ve 600 ila 650 nanometre için ayarlanmış spektral tarama prizmasını kullanarak PI floresansını tespit edin. AF 647 floresan için 633 nanometre helyum-neon lazeri ve 650 ila 700 nanometre için ayarlanmış spektral tarama prizmasını kullanın. P1 ve AF 647'den sırayla, 1024 x 1024 piksel ve tüm hücre kalınlığı boyunca 0,5 mikron aralıklarla alınan 2X çizgi ortalamasıyla görüntüler toplayın. Görüntüleri Z projeksiyonları olarak sunun.

Hücreleri analiz etmek için, sitoplazmadaki hücre içi floresansın gruplanmış ve hücre yüzeyine yakın mı yoksa dağınık ve homojen mi olduğunu değerlendirin ve kaydedin. Ayrıca, hücre başına bağıl floresan yoğunluğunu değerlendirin.