Aβ Peptit Spesifik Antikorların ve Aβ Oligomerlerinin Sıçan Hipokampusuna Kontrollü İnfüzyonu

Hipokampusa bilateral olarak implante edilmiş iki kılavuz kanül ile uyanık bir sıçan alın.

Kanüller, sırasıyla amiloid-beta veya Aβ-spesifik ve kontrol antikorları içeren deri altına implante edilmiş ozmotik pompalara bağlanır.

Pompa içindeki yüksek bir antikor konsantrasyonu, ozmotik tabakayı genişleterek dış yarı geçirgen zarı boyunca çevredeki dokudan su difüzyonunu indükler.

Bu genişleme, antikor rezervuarını sıkıştırarak kontrollü antikor salınımını kolaylaştırır.

Bir infüzyon pompasına bağlı steril su dolu kateterlere iki dahili kanül takın.

Kanülleri suyla doldurun.

Ardından, bir kabarcık oluşturarak küçük bir hacimde hava aspire edin.

Şimdi, kanülleri nörotoksik Aβ oligomerleri, Aβ peptitlerinin çözünür agregatları ile doldurun.

Dahili kanülleri kılavuz kanüllere yerleştirin. Geri akışı önlemek ve infüzyon hızını izlemek için hava kabarcığını kullanarak oligomerlerin kontrollü bir şekilde iletilmesi için pompayı çalıştırın.

Gerekli süre boyunca tekrarlanan oligomer enjeksiyonlarını uygulayın.

Model, Aβ oligomer-antikor etkileşimlerini incelemek için hazırdır.

Kurulumdan bir gün önce, ozmotik pompaları üreticinin talimatlarına göre 6E10 antikoru ile doldurun veya IgG1 antikorunu kontrol edin. Pompaları steril damıtılmış suya yerleştirin ve pompaları etkinleştirmek için gece boyunca 37 santigrat derecede tutun.

Sıçan% 3 izofluran ile uyuşturulduktan ve kürek kemikleri arasında traş edildikten sonra, cildi% 2 klorheksidin glukonat ve% 2 izopropil alkol çözeltisi ile dezenfekte edin. Kürek kemikleri arasında neşter ile 2 santimetrelik bir kesi yaptıktan sonra, kılavuz kanüle bağlı PE-50 kateterlerini bulun.

Daha sonra, diş çimentosu içeren PE-50 kateterlerinin uçlarını bir neşter ile kesin. Ozmotik pompaları PE-50 kateterlerine bağlayın ve bağlantıyı sabitlemek için pompa ve kateter bağlantısına bir miktar diş çimentosu ekleyin. Son olarak, cildi 4/0 dikişlerle sıkıca dikin. Hayvanı ılık bir ısı yastığının üzerine kafesine geri koyun ve izofluran anestezisinden uyanırken izleyin.

Amiloid-beta oligomer çözeltisini daha önce bildirildiği gibi hazırladıktan sonra, çözeltinin infüzyondan önce oda sıcaklığında 1 saat boyunca dinamik ve kendiliğinden toplanmasına izin verin. Ardından, her şırıngayı 5 mikrolitre steril damıtılmış su ile doldurun.

Daha sonra, iki PE-50 kateterini bir neşter ile yaklaşık 60 santimetre uzunluğunda kesin. Her iki kateteri de steril damıtılmış suyla doldurmak için 21 gauge iğnelerle donatılmış iki adet 1 mililitrelik şırınga kullanın. 1 mililitrelik şırıngalar yerinde kalırken, her kateterin bir ucunda serbest uçları Hamilton şırıngalarına bağlayın. 1 mililitrelik şırıngaları çıkarın ve kateterlerde hava kabarcığı olmadığını kontrol edin.

Dahili kanülü PE-50 kateterlerinin ucuna yerleştirin. Her bir iç kanülü 1 mikrolitreye kadar doldurmak için Hamilton şırıngalarını kullanın, ardından pistonu 2 mikrolitre işaretine geri çekerek bir hava kabarcığı yapın.

Şimdi amiloid-beta oligomer çözeltisini, minimum yapışma ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Karıştırma sırasında kabarcık oluşturmaktan kaçının. Ardından, pistonları 3,5 mikrolitreye geri çekerek her iki iç kanülü 1,5 mikrolitre amiloid-beta oligomer solüsyonu ile doldurun.

Ardından, her iki kateterdeki hava kabarcığından önceki ve sonraki çizgileri işaretleyin. Bu, devam eden infüzyonun bir kontrol noktası olarak hizmet eder. Uyanık fareyi sıkı bir şekilde tutun ve başını hareketsiz hale getirin. Kukla kanülü iki kılavuzlu kanülden çıkarın, ardından önceden hazırlanmış iç kanülü kılavuz kanüle yerleştirin. Kılavuz kanülün tabanına tam olarak yerleştirildiklerini ve iyi bir şekilde sabitlendiklerini doğrulayın. Şimdi, fareyi sıkı tutuştan serbest bırakın ve taşıma stresini sınırlamak için kafesine geri koyun.

İnfüzyon pompasını açın ve dakikada 0.1 mikrolitre oranında 1 mikrolitre amiloid-beta oligomer çözeltisi enjekte edin. İnfüzyon sırasında, şırınga pistonunun 3,5 mikrolitreden 2,5 mikrolitreye hareket ettiğini ve her iki PE-50 kateterindeki hava kabarcıklarının sürekli hareket ettiğini kontrol edin. Kateterlerin birlikte bükülmediğinden emin olmak için fareyi kontrol edin.

Amiloid-beta oligomer çözeltisinin verimli bir şekilde difüzyonunu sağlamak için infüzyondan sonra iç kanülü 5 dakika daha yerinde bırakın. İnfüzyondan sonra, fareyi sıkı tutma yerine geri getirin ve enjekte edilen solüsyonun geri akışını önlemek için iç kanülü ve kapaklı kılavuz kanülü çıkarın. Kılavuz kanülün açı kolunun hemen önünde duran sahte kanülü yerleştirin. Son olarak, hayvanı kafesine geri koyun.