Kalsiyum İndikatör Boyası Kullanarak T Hücresi Reseptörü ile İndüklenen Kalsiyum Akışının Değerlendirilmesi

Bir fare T hücresi süspansiyonu ile başlayın ve bir kalsiyum indikatör boyası - Hint-1-asetoksimetil ester ekleyin.

Boya, hücre içi esterazların asetoksimetil grubunu parçalayarak zar geçirimsiz Hint-1 oluşturduğu hücrelere girer, bu da kalsiyum içermeyen ve kalsiyuma bağlı formlarda farklı floresan sergiler.

Spesifik olmayan etkileşim bölgelerini bloke etmek için Fc reseptör antikorları ekleyin.

T hücresi alt kümelerini boyamak için florofor işaretli antikorları tanıtın.

Bağlanmamış antikorları çıkarın ve canlı ve ölü hücreleri farklı şekilde lekeleyen bir canlılık boyası ile boyayın.

Akış sitometrisinde, başlangıçta canlı hücrelerin loş floresansını tespit edin ve florofor etiketli T hücrelerini tanımlayın, ardından bu hücreler içindeki Indo-1 floresansını ölçün.

T hücresi reseptörü CD3 kompleksi ile etkileşime giren ve T hücresi sinyal yollarını aktive ederek sitozole kalsiyum akışını indükleyen anti-CD3 antikorları ile tedavi edin.

Hint-1 boyası, salınan kalsiyum iyonları ile etkileşime girerek boyanın floresansını maviden mora değiştirir.

Hint-1 floresansındaki kalsiyumsuz durumlardan kalsiyuma bağlı durumlara geçiş, T hücresi reseptörünün neden olduğu kalsiyum akışını doğrular.

Başlamak için, 50 mikrogram Indo-1 içeren bir şişeye 50 mikrolitre DMSO ekleyerek mikrolitre stok başına 1 mikrogram Indo-1 hazırlayın. Stok çözeltisini mililitre başına 6 mikrogram konsantrasyonda uygun bir cRPMI hacmine seyreltin.

Ortamı 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Daha sonra, mililitre başına 5 ila 6 milyon hücre elde etmek için önceden hazırlanmış bir hücre süspansiyonunu 1'e 1 oranında seyreltmek için bu ortamı kullanın. Daha sonra, 12 oyuklu bir doku kültürü plakasına, deney koşulu başına oyuk başına 1 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Indo-1 boya yüklü hücrelere EGTA ekleyerek kalsiyum içermeyen Indo-1 için tek lekeli bir kontrol numunesi hazırlayın. Florofor veya Hint-1 boyası içermeyen biyolojik negatif kontrol için bir kuyuyu onarın. Akış sitometresindeki boya yüklü hücre süspansiyonuna 50 mikromol konsantrasyonunda iyonomisin ekleyerek bir Indo-1 pozitif kontrolü hazırlayın.

Ayrıca, antikor konjuge floroforlar kullanarak ek hücre popülasyonları için tek leke kontrolleri için bir kuyu hazırlayın. Daha sonra milyon hücre başına 2 mikrogram FC reseptör bloke edici antikor ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse etmek için her 15 dakikada bir dokunarak plakayı 45 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, tüm hücre hacmini plakadan karıştırın ve çıkarın ve 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine ekleyin. Süpernatanı santrifüjleyin ve boşaltın. Hücreler 1 mililitre önceden ısıtılmış cRPMI ile yıkandıktan sonra, tekrar pelet yapın ve süpernatanı boşaltın.

Hücreleri 1 mililitre cRPMI'de yeniden süspanse edin ve her bir tüpü inkübe edin, tüpün üst kısmını gaz değişimi için hafifçe açık bırakın, bu da hücre içi esterlerinin tamamen de-esterleşmesine izin verir. Daha sonra, tüm kullanıcı tanımlı florokrom konjuge antikorların bir ana karışımını hazırlayın ve hücre hacminin 1 mililitresi için dinlenme hücrelerine ekleyin.

Dinlendikten sonra, hücreleri pelet haline getirin ve peleti 4 santigrat dereceye soğutulmuş 1 mililitre cRPMI'de yeniden süspanse ederek yıkayın. Bu adımı tekrarlayın ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Kapaklı 5 mililitrelik polistiren akış tüpü kullanarak 500 mikrolitre fenol kırmızısı içermeyen cRPMI'de tek tek numuneleri yeniden süspanse edin.

Kalsiyum akı analizini kullanarak sıcaklığı korumak için, küçük bir su banyosuna banyo boncukları ekleyerek bir boncuk banyosu hazırlayın ve 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. 50 mililitrelik konik bir tüpü dikkatlice ikiye bölün ve tüpün üst kısmını atın. Kalan tüpün 3 / 4'ünü banyo boncukları ile doldurun ve boncuk banyosunda 37 santigrat dereceye ulaşmasını sağlayın.

Boncuk banyosunu, tüpü konumlandırmak için bir strafor raf ile birlikte bir akış sitometresinin yanına yerleştirin. Akış sitometresindeki analizden önce, tüpleri ayrı ayrı yedi dakika boyunca 37 santigrat dereceye ısıtın. Akış sitometresi yazılımına giriş yapın ve Kitaplık sekmesine tıklayın.

Ardından, kalsiyuma bağlı Hint-1 ve kalsiyumsuz Hint-1 eklemek için floresan etiketleri seçin. Ardından, floresan etiket grupları altında UV lazeri seçin ve bir floresan etiket adı eklemek için Artı Ekle'ye tıklayın. Lazer uyarma ve emisyon dalga boyunu seçin ve ardından Kaydet'e tıklayın.

Deney düzeneğine devam edin. Edinme sekmesine tıklayın. Yeni bir deney açın veya oluşturun ve istediğiniz floresan etiketlerini deneye ekleyin. Deneme için bir başvuru grubu ve yeni bir örnek grubu oluşturun ve her iki grubu da etiketleyin.

Alımlar sekmesi altında, olayları maksimum 10 milyona, hacmi maksimum 3.000 mikrolitre hacme ve durma süresini maksimum 36.000 saniyeye ayarlayacak şekilde ayarlayın. Çok renkli panelde bulunan kullanıcı tanımlı konjuge antikorlar ve Indo-1 fonksiyonel boya için tek lekeli kontroller edinin.

Kalsiyuma bağlı Indo-1 pozitif kontrolüne ve girdabına 50 mikromol iyonomisin ekleyin. Akış tüpünü numune enjeksiyon kartına ekleyin ve Kaydet'e tıklayın. Ardından, akış sitometresine kalsiyum içermeyen Indo-1 negatif kontrolü ekleyin ve Kaydet'e tıklayın.

Unmix düğmesine tıklayarak tek lekeli kontrollerin karışımını kaldırın. Karıştırma işlemi tamamlandıktan sonra, Karıştırılmamış Çalışma Sayfasını kullanarak, numunedeki kalıntıları çıkarmak için SSCA'ya karşı FSCA ve çiftleri çıkarmak için SSCA'ya karşı SSCH gibi sıralı grafikler oluşturun.

Ardından Arsa'ya tıklayarak kapılar oluşturun. Çalışma sayfasına bir çizim ekleyin ve aşağı akış kapılı bir popülasyon oluşturmak için geçidin içine çift tıklayın. İlgilenilen tüm popülasyonlar hesaba katılana kadar devam edin. Daha sonra, önceden hazırlanmış tek lekeli kontrol numunelerini sıralı analiz için 37 santigrat dereceye ısıtın.

Akış sitometrisi yazılımını kurun ve akış sitometresinin akışkan stabilitesini sağlamak için 2 ila 3 dakika deiyonize su çalıştırın. İlgilenilen popülasyonu dahil etmek için çokgen, dikdörtgen veya elips kapı düğmelerini kullanarak kapılar oluşturarak, karıştırılmamış çalışma sayfasında sıralı çizimler ayarlayın.

Geçidin içine çift tıklayın ve y ve x ekseni parametrelerini SSCA ve SSCH olarak değiştirin. Eksene sol tıklayarak eksen parametrelerini tanımlamayı tamamlayın. SSCA'ya karşı canlılık boya sinyali ile bir çizim oluşturun. Negatif veya amin boya boyası lekesi olan canlı hücreleri kapatın.

Canlı ölü boyama için negatif olan canlı hücreler, hem y hem de x ekseninde sıfır işaretinde kümelenecektir. Yalnızca tek hücreli canlı lenfositleri içeren yeni bir çizim oluşturmak için iç çizime çift tıklayın. Kalsiyum akışını görselleştirmek için y eksenini x ekseninde zamana karşı bire değiştirin.

Ardından, ısıtılmış biyolojik numuneyi makinenin SIT'ine yerleştirin. Sınırlı sayıda hücre popülasyonunda kalsiyum akışını görselleştirmek için numuneleri orta akış hızında saniyede 2.500 ila 3.000 olayda çalıştırın. Bir sonraki tüpü boncuk banyosuna ekleyin.

Edinme kontrolünde, numunede bazal düzeyde bir kalsiyum sinyali elde etmek için ilk verileri 30 saniye boyunca kaydetmek için Kaydet'e basın. Ardından Durdur'a tıklayın ve tüpü numune enjeksiyon portundan çıkarın. Kalsiyum akışını başlatmak için 30 mikrogram konjuge olmayan anti-CD3'ü doğrudan numune tüpüne ekleyin.

Tüpü hızlı bir şekilde numune enjeksiyon portuna geri yerleştirin ve yazılımda Kaydet'e basın. Yazılımdaki alım kontrolleri altında geçen süreyi izleyerek verileri yedi dakika boyunca kaydedin. Ardından yazılımda Durdur'a basın.