Kalsiyum İndikatör Boyası Kullanarak T Hücresi Reseptörü ile İndüklenen Kalsiyum Akışının Değerlendirilmesi
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 8:14 dk. • July 8th, 2025
Bir fare T hücresi süspansiyonu ile başlayın ve bir kalsiyum indikatör boyası - Hint-1-asetoksimetil ester ekleyin.
Boya, hücre içi esterazların asetoksimetil grubunu parçalayarak zar geçirimsiz Hint-1 oluşturduğu hücrelere girer, bu da kalsiyum içermeyen ve kalsiyuma bağlı formlarda farklı floresan sergiler.
Spesifik olmayan etkileşim bölgelerini bloke etmek için Fc reseptör antikorları ekleyin.
T hücresi alt kümelerini boyamak için florofor işaretli antikorları tanıtın.
Bağlanmamış antikorları çıkarın ve canlı ve ölü hücreleri farklı şekilde lekeleyen bir canlılık boyası ile boyayın.
Akış sitometrisinde, başlangıçta canlı hücrelerin loş floresansını tespit edin ve florofor etiketli T hücrelerini tanımlayın, ardından bu hücreler içindeki Indo-1 floresansını ölçün.
T hücresi reseptörü CD3 kompleksi ile etkileşime giren ve T hücresi sinyal yollarını aktive ederek sitozole kalsiyum akışını indükleyen anti-CD3 antikorları ile tedavi edin.
Hint-1 boyası, salınan kalsiyum iyonları ile etkileşime girerek boyanın floresansını maviden mora değiştirir.
Hint-1 floresansındaki kalsiyumsuz durumlardan kalsiyuma bağlı durumlara geçiş, T hücresi reseptörünün neden olduğu kalsiyum akışını doğrula
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin