JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 4:24 dk • July 8th, 2025
İnsan bağırsak bakterilerinin bir süspansiyonunu içeren bir tüp alın.
İnsan norovirüs virüsü benzeri parçacıklar veya VLP'ler ekleyin. VLP'ler sağlam bir viral kapsid içerir, ancak genomik RNA'dan yoksundur, bu da onları insanlar için bulaşıcı olmayan hale getirir.
İnkübasyon sırasında, VLP kapsid proteinleri, bakteri yüzeyinde eksprese edilen spesifik karbonhidratlara bağlanarak VLP-bakteri kompleksleri oluşturur.
Kompleksleri peletlemek için santrifüjleyin ve bağlanmamış VLP'leri atın.
Spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için protein içeren bir bloke edici çözelti uygulayın ve sonraki adımlarda arka plan lekelenmesini azaltın.
Floresan etiketli VLP'ye özgü antikorlar ekleyin ve inkübe edin.
Antikorlar, VLP kapsid üzerindeki hedef bölgelerine bağlanarak VLP-bakteri komplekslerini etiketler.
Kompleksleri peletlemek için santrifüjleyin. Bağlanmamış antikorları atın ve peleti bir akış sitometrisi tamponunda yeniden süspanse edin.
Bir akış sitometresi kullanarak, VLP-bakteri kompleksleri tarafından yayılan floresan sinyallerini tespit edin ve numunedeki bağlı bakteri yüzdesinin ölçülmesine izin verin.
Reaktifleri, antikorları ve bakterileri el yazmasında anlatıldığı gibi hazırladıktan sonra, tüm malzemeleri bir BSL II biyogüvenlik kabininde birleştirin.
İnsan norovirüsü için virüs benzeri parçacıklar BSL II patojenleri olarak listelenmiştir ve VLP'ler kullanılarak gerçekleştirilen tüm çalışmalar sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
Her bakteri tüpüne 10 mikrogram insan norovirüs VLP'si ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Tüpleri sabit dönüşle 37 santigrat derecede 1 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpleri 5 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjleyin.
Süpernatanı aspire edin ve atın ve bakteri peletini 1 mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Yıkama adımlarını bir kez tekrarladıktan sonra, tüpleri 5 dakika boyunca 10.000 kez g'de tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve VLP bakteri peletini 150 mikrolitre% 5 bloke edici tamponda yeniden süspanse edin.
Ortaya çıkan yaygın bir hata, tüplerin değiştirilmesi ve yanlış tedavinin eklenmesidir. Bunu önlemek için, tüm tüpleri doğru tedaviye karşılık gelen çizgilere yerleştirin ve tüplere bir kerede bir tedavi ekleyin.
Her bakteri örneği için 50 mikrolitre seyreltilmiş insan norovirüsü G2 antikoru hazırlayın. % 5 bloke edici tampon kullanarak, E. coli vaka örnekleri için antikoru 1 ila 125 oranında seyreltin. Aynı seyreltme oranlarını kullanarak her bakteri numunesi için 50 mikrolitre seyreltilmiş izotip antikor hazırlayın. Her bir ek tahlil örneğini temiz 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktararak 350 mikrolitrelik alikotlara bölün.
Lekesiz kontroller oluşturmak için, her bakteri örneğinden ilk alikota 50 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin. Lekeli numuneler için, ikinci alikot setine 50 mikrolitre G2 antikor seyreltmesi ekleyin. Üçüncü alikot setine 50 mikrolitre seyreltilmiş izotip antikoru ekleyerek izotip kontrollerini oluşturun.
Tüm numuneleri buz üzerinde ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Ardından, tüm numuneleri 5 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanları atın ve her numuneyi 150 mikrolitre FCSB'de yeniden süspanse edin. Yine, tüm numuneleri 5 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjleyin. Yine, süpernatanları atın ve numuneleri 100 mikrolitre FCSB'de yeniden süspanse edin.
Numuneleri son bir kez santrifüjledikten ve süpernatanı attıktan sonra, numuneleri 150 mikrolitre FCSB'de yeniden süspanse edin. Her numuneyi toplam 550 mikrolitre hacim için 400 mikrolitre FCSB içeren bir tüpe aktarın. Numuneleri akış sitometrisi ile analiz edilene kadar 4 santigrat derecede saklayın.