Transgenik Nematodlarda Mitofajiyi Tespit Etmek için İn Vivo Bir Test
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:39 dk. • July 8th, 2025
Bir dış mitokondriyal membran proteini olan yeşil florofor etiketli DCT-1 ve bir fagofor membran proteini olan kırmızı florofor etiketli LGG-1'i eksprese eden vücut duvarı kas hücreleri ile transgenik nematodları alın.
Solucanları, mitofajiye neden olan bir ilaç içeren bir büyüme ortamının üzerine yerleştirin.
İlaç, hücresel mitokondriye zarar verir, mitofajiyi veya hasarlı mitokondrinin seçici klerensini başlatır.
Hasarlı mitokondri üzerindeki DCT-1, fagofor zarı üzerindeki LGG-1 ile etkileşimi kolaylaştırarak ubikitinasyon ve fosforilasyona uğrar.
Fagofor, lizozomal bozunmayı hedefleyen bir otofagozom oluşturmak için mitokondri etrafında genişler.
Nematodları hareketsiz hale getirmek için bir mikroskop lamı üzerine anestezik içine yerleştirin ve bir lamel yerleştirin.
Bir floresan mikroskobu altında, yeşil floresan yayan DCT-1 ve kırmızı floresan gösteren LGG-1'in birlikte lokalizasyonunu gösteren kas hücreleri içindeki sarı noktaları görselleştirin. Bu, mitofaji oluşumunu doğrular.
Birinci gün, vücut duvarı kas hücrelerinde hem DCT-1::GFP hem de DsRed::LGG-1 eksprese eden transgenik hayvanların L4 larvalarını toplayın ve bunları OP50 tohumlu bir nematod büyüme ortamı plakasına y
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin