JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 4:36 dk. • July 8th, 2025
Çoklu protein tespiti için proteine özgü yakalama antikorları içeren farklı noktalara sahip önceden işlenmiş bir mikrodizi tahlil slaydı monte ederek başlayın.
Protein standardının dilüsyonlarını ve önceden seyreltilmiş serum örneklerini ayrı kuyucuklara yükleyin. Bu seyreltmeler, doğru miktar tayini için bir dizi protein konsantrasyonu oluşturur.
Protein-antikor etkileşimlerini kolaylaştırmak için inkübe edin. Bağlanmamış proteinleri çıkarmak için yıkayın, slaytı sökün ve kurutun.
Tahlil slaytını, tahlil lamı ile aynı pozisyonlarda proteine özgü biyotinillenmiş tespit antikorları ile lekelenmiş yeniden sulandırılmış bir transfer lamı içeren bir çıtçıt aparatında ters çevirin.
Cihazı kapatın ve slaytları birbirinin üzerine oturtmak için bastırın. Bu, tespit antikorlarının tahlil lamı üzerindeki karşılık gelen noktalara transferini kolaylaştırır ve çapraz reaktiviteyi en aza indirir.
Tespit antikorlarının bağlı proteinlerle etkileşimine izin vermek için slaytları ayırın ve immünokompleksler oluşturun.
Tahlil slaytını yeniden birleştirin, durulayın ve biyotinile antikorlarla etkileşime giren florofor konjuge streptavidin ekleyin.
Bir tarayıcı kullanarak, serum örneğinde birden fazla protein olduğunu gösteren çeşitli konumlardaki floresan noktalarını tespit edin. Nokta yoğunluklarını protein miktar tayini standardı ile karşılaştırın.
İmmünoassaye başlamak için, hazırlanan tahlil slaytını dondurucudan çıkarın ve kapalı torbasında 30 dakika boyunca oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. PBS'de% 0.05 polisorbat-20 ile seri olarak seyreltilmiş yedi protein çözeltisi hazırlayın. Aynı tamponda uygun şekilde seyreltilmiş numune çözeltileri hazırlayın.
Oda sıcaklığındaki tahlil slaytına 24 oyuklu bir silikon conta sıkıştırın. Yedi protein dilüsyonunu bir sütundaki sekiz kuyucuğun yedisine yükleyin. % 0.05 polisorbat-20 içeren protein içermeyen PBS'yi bu sütunun son kuyusuna yükleyin. Numune çözeltilerini kalan kuyucuklara yükleyin.
Slaytları oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 450 santigrat derecede 450 RPM'de çalkalayın. Ardından sürgüyü üç kez yıkayın. Contayı çıkarın ve sürgüyü bir nitrojen gazı akışı altında kurutun.
Daha sonra, tespit antikor transfer slaytının kapalı torbasında 30 dakika boyunca oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Ardından, dizileri yeniden sulandırmak için slaytları %60 bağıl neme sahip kapalı bir odada 20 dakika inkübe edin. Algılama transfer sürgüsünü yüzü yukarı bakacak şekilde çıtçıt aparatına sabitlemek için pogo pimlerini kullanın.
Tahlil sürgüsünü yüzü aşağı bakacak şekilde pogo pimlerinin üzerine yerleştirin ve sürgüyü düz pimlerle hizalayın. Aparatı kapatın ve tespit antikorlarını tahlil slaytına hızlı bir şekilde aktarın. Slaytları aparattan çıkarın ve tahlil slaytını bir saat inkübe edin.
Sürgüye 24 oyuklu bir silikon conta sıkıştırın ve sürgüyü üç kez yıkayın. Daha sonra, PBS'de mililitre streptavidin florofor çözeltisi başına 2.5 mikrogramlık bir kuyucuğa 80 mikrolitre yükleyin. Slaytı 450 RPM'de 20 dakika sallayın.
Slaytı PBS'de% 0.1'lik bir polisorbat-20 çözeltisi ile üç kez ve bir kez damıtılmış suyla yıkayın. Ardından contayı çıkarın ve sürgüyü kurutun. Slaytı bir floresan tarayıcı ile tarayın ve nokta yoğunluklarını ölçün. Tespit sınırlarını ve protein konsantrasyonlarını belirleyin.