İmmünoterapiye Dirençli T Hücresi Alt Popülasyonlarını Analiz Etmek için Çoğullanmış İmmünofloresan Görüntüleme

Tümör mikroçevresinde sızan CD8 + T hücreleri sergileyen bir renal hücreli karsinom dokusu kriyoseksiyonu alın.

Dokuyu sabitlemek ve geçirgen hale getirmek için aseton ile tedavi edin. Fazla asetonu çıkarmak için yıkayın.

Endojen doku biotinini doyurmak için avidin ekleyin. Daha sonra, hareketsiz avidin bağlanma bölgelerini bloke etmek ve spesifik olmayan etkileşimleri en aza indirmek için biyotin ekleyin.

Bağışıklık hücresi Fc reseptörlerini bloke etmek için immünoglobulinler içeren serum uygulayın ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını önleyin.

Sitotoksik bir T hücresi belirteci olan CD8'i ve immünoterapiye dirençli CD8 + T hücresi alt popülasyonları tarafından eksprese edilen inhibitör reseptörler olan PD-1 ve Tim-3'ü hedefleyen bir birincil antikor kokteyli ekleyin.

Anti-CD8 ve anti-Tim-3 antikorlarını hedefleyen farklı florofor işaretli ikincil antikorları tanıtın.

Anti-PD-1 antikorlarını hedefleyen biyotinile edilmiş ikincil antikorlar ve biotin'e farklı bir florofor işaretli streptavidin bağlanması ekleyin.

Hücre çekirdeklerini boyamak için boya içeren bir montaj ortamı uygulayın ve bir lamel yerleştirin.

Tümöre sızan CD8 + T hücrelerini ve PD-1, Tim-3 veya her ikisini birden eksprese eden immünoterapiye dirençli alt popülasyonları tanımlamak için multispektral floresan görüntüleri elde edin.

Çözüldükten sonra, doku bölümlerinin etrafındaki slaytları dikkatlice kurutmak için bir kağıt havlu kullanın ve dokuları hidrofobik bir bariyer kalemle çevreleyin. Bariyer kuruduğunda, numuneleri 5 dakika boyunca %100 asetonda sabitleyin, ardından 2 dakika havayla kurutun. Ardından, slaytları TBS'de 10 dakika yıkayın.

Slaytları karanlıkta 10 dakika boyunca üç damla% 0.1 avidin ile ön işlemden geçirin. Ardından, dokuyu avidin solüsyonu ile kaplamak için slaytlara dokunun veya hafifçe vurun. Her numuneye üç damla% 0.01 biyotin ekleyin ve biyotini numuneler boyunca hafifçe vurun veya hafifçe vurun, ardından gösterildiği gibi bir TBS yıkaması yapın. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca TBS'de 100 mikrolitre% 5 normal serum ile spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.

İnkübasyonun sonunda, fazla serumu çıkarmak için slaytlara dokunun ve slaytları nemlendirilmiş bir odada 1 saat boyunca ilgilenilen birincil antikor kokteylinin 100 mikrolitresinde inkübe edin. Antikor etiketli slaytları TBST'de 5 dakika yıkayın.

Kuruduktan sonra, hücreleri nemlendirilmiş odada 30 dakika boyunca 100 mikrolitre ikincil antikor kokteyli ile etiketleyin, ardından TBS'de 10 dakikalık bir yıkama yapın. Kurutulmuş ikincil antikor etiketli slaytları, ilgilenilen üçüncül antikor kokteylinin 100 mikrolitresi ile 30 dakika boyunca inkübe edin, ardından son 10 dakikalık bir TBS yıkaması yapın.

Yıkamanın sonunda, slaytları kurutun ve dokuları DAPI takviyeli montaj ortamı ile monte edin. Ardından, her bir sürgüyü bir kapak kızağı ile örtün ve montaj ortamının en az 2 saat sertleşmesine izin verin.

Slaytları taramak için mikroskop yazılımını açın ve görüntü tarama protokolünü yükleyin. İlk slaydı mikroskop tablasına yükleyin. Ardından, kontrol çubuğunda Pozlamayı Ayarla'yı tıklatın ve yeterli ancak doygunluk olmayan bir sinyal elde edilene kadar her filtre için pozlama süresini ayarlayın.

Üst panelde Başlat'a tıklayın ve laboratuvar kimliği klasörünü açın. İlk slaydın kimliğini girin ve İleri'yi tıklatın.

4x büyütmede parlak alan ışığı altında slaytın genel bakışını elde etmek için Tek Renkli Görüntüleme ve Örnek Bul'a tıklayın. Taranacak doku alanını seçmek için Control tuşuna basın ve 4x büyütmede taranacak ilgili bölgeleri seçmek veya seçimlerini kaldırmak için imleci kullanın.

Her bölgenin floresan kırmızı-mavi-yeşil görüntüsünü elde etmek için, Düşük Güçlü Görüntüleme'yi tıklatın. Yüksek güçlü alan seçimi için Control tuşuna basın ve dokunun 20x büyütmede taranacak alanlarına karşılık gelen en az beş ilgi alanı seçin.

Ardından, her alanın multispektral görüntü alımını elde etmek için, Yüksek Güçlü Görüntüleme'yi tıklatın ve görüntüleri uygun laboratuvar kimliği klasöründe depolamak için Veri Depolama'yı tıklatın.