Enfekte Hücrelerde Viral Protein Lokalizasyonu için Bir İmmünofloresan Tekniği

Yapışmış konak hücreleri içeren bir slaytla başlayın.

Virüsleri ekleyin ve konakçı hücrelere girmelerine izin verin.

Harcanan ortamı çıkarın. Viral protein sentezini ve taşınmasını sağlamak için taze ortam ekleyin.

Hücre morfolojisini ve protein konumunu korumak için paraformaldehit kullanın.

Hücreleri geçirgen hale getirmek için deterjan molekülleri ekleyin.

Hedef olmayan bağlama sitelerini engellemek için bir engelleme arabelleği uygulayın.

Hedef viral proteinleri bağlayan birincil antikorları ekleyin. Bağlanmamış antikorları çıkarın.

Viral proteinleri floresan olarak etiketlemek için kırmızı florofor konjuge ikincil antikorlarla kaplayın. Bağlanmamış antikorları çıkarın.

Çekirdekleri boyamak için floresan nükleer boya içeren bir montaj ortamı ekleyin.

Konfokal mikroskopi kullanarak, kırmızı floresan viral proteinlerin ve mavi floresan konak çekirdeklerinin yerini gözlemleyin.

Mavi alanın etrafındaki daha güçlü bir kırmızı sinyal sitoplazmik lokalizasyonu gösterirken, iç kısımdaki daha güçlü bir sinyal nükleer lokalizasyonu gösterir.

Mavi alanın içindeki ve çevresindeki eşit sinyal seviyeleri, proteinlerin hem çekirdekte hem de sitoplazmada bulunduğunu gösterir.

Virüs enfeksiyonundan 20 ila 24 saat önce, 5 x 10⁴ insan embriyonik akciğeri veya HEL fibroblast hücresini, 37 santigrat derecede gece boyunca inkübasyon için büyüme ortamında 4 oyuklu 11 milimetrelik kademeli bir slayta tohumlayın,% 5 karbondioksit ile.

Kültür ortamının dökülmesini önlemeye özen gösterirken, hücrelerin eşit bir şekilde dağılmasını sağlamak için sürgünü iyice sallamak önemlidir. Ertesi gün, %70 ila %80 birleşik kültürlerin süpernatantlarını, hücre başına 4-10 plak oluşturan birim içeren Medium-199 ile değiştirin ve slaytı 1 saat çalkalayarak 37 santigrat dereceye yerleştirin.

Kuluçka süresinin sonunda, süpernatanları taze büyüme ortamı ile değiştirin ve hücreleri uygun deneysel enfeksiyon süresi için inkübatöre geri koyun. Virüsle enfekte olmuş hücrelerin immünofloresan boyaması için, hücreleri PBS ile üç kez hızlı bir şekilde yıkayın, ardından kuyucuk başına PBS'de 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit içinde 8 ila 10 dakikalık bir inkübasyon yapın. Fiksasyonun sonunda, hücreleri yıkama başına 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın ve hücreleri 5 ila 10 dakika boyunca oyuk başına 100 mikrolitre% 0.2 iyonik olmayan yüzey aktif madde ile geçirgenleştirin.

Geçirgen hücreleri gösterildiği gibi PBS'de üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saatlik bir inkübasyon için her bir oyuğa 200 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin. Daha sonra, 2 saatlik oda sıcaklığında bir inkübasyon için her bir oyuğa ilgilenilen birincil antikorun uygun konsantrasyonunu ekleyin.

İnkübasyonun sonunda, taze bloke edici tamponda 10 dakikalık üç yıkama ile bağlanmamış herhangi bir birincil antikoru çıkarın ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 1 saatlik bir inkübasyon için her bir oyuğa uygun bir ikincil antikor ekleyin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri gösterildiği gibi bir bloke edici tamponda üç kez yıkayın, ardından PBS'de bir yıkama yapın ve her bir oyuğa DAPI ile takviye edilmiş bir damla solma önleyici montaj ortamı ekleyin. Ardından lamel üzerine bir lamel yerleştirin ve lamel şeffaf oje ile kapatın.

Lameli monte ederken hafif bir baskı uygulamak, fazla montaj ortamını ortadan kaldırarak yüksek kaliteli görüntülerin elde edilmesini sağlamaya yardımcı olur.

ICP0'ın nükleer ve sitoplazmik dağılımını analiz etmek için projeyi konfokal uygulama yazılımında açın ve bir görüntü seçin. Miktar sekmesini açın ve Araçlar menüsünden İlgilenilen Bölgeleri Sırala'yı seçin. Çizgi Çiz'i seçin ve analiz edilecek hücre boyunca uzunlamasına bir çizgi çizin. Hem ilgilenilen protein hem de DAPI için çizgi boyunca floresan yoğunluğunu gösteren bir histogram görünecektir.

Arka plan boyamaya dayanarak, her deneyde proteinin hücre altı dağılımının analizi için ilgilenilen proteinin yoğunluğu için sabit bir eşik belirleyin. Protein sinyali ortalama olarak nükleer bölgedeki eşiğin altındaysa, ancak DAPI sınırının ötesindeki eşiğin üzerindeyse, protein sinyalini ağırlıklı olarak sitoplazma içinde yer alacak şekilde sınıflandırın.

Protein sinyali çekirdek boyunca eşiğin üzerindeyse ve DAPI sinyalinin sınırının ötesindeyse, protein sinyalini bir çekirdek artı sitoplazmik lokalizasyon olarak gruplandırın. Protein sinyali çekirdekteki eşiğin üzerindeyse, ancak ortalama olarak DAPI sinyalinin sınırının dışındaki eşiğin altındaysa, protein sinyalini nükleer bir lokalizasyon olarak gruplandırın.