Aspirin ve İbuprofen'in Makrofajların Fagositik Yeteneği Üzerine Etkisi

Cryptococcus'un mantar süspansiyonu ile başlayın. Cryptococcus hücrelerini lekelemek için pH'a duyarlı bir floresan boya ile konjuge edilmiş mantar türevi biyopartiküllerden oluşan bir çözelti ekleyin.

Bağlanmamış boyayı çıkarmak için yıkayın. Lekeli mantar süspansiyonunu, yapışmış makrofajlar veya fagositik bağışıklık hücreleri ile çok kuyulu bir plakaya aktarın.

Aspirin veya ibuprofen gibi bir ilacın minimum inhibitör konsantrasyonunu tanıtın ve ilaç alımını kolaylaştırmak için inkübe edin.

İlaç molekülleri, prostaglandin sentezleyen bir enzim olan siklooksijenaz-2 ile etkileşime girerek aktivitesini inhibe eder.

Bu, araşidonik asidin prostaglandine dönüşümünü önler, hücre içi cAMP seviyelerini korur ve makrofaj fagositik yeteneğini arttırır, mantarların içselleştirilmesini kolaylaştırır.

Mantar içeren fagozom, asidik bir organel olan lizozom ile birleşerek asidik pH'lı bir fagolizozom oluşturur ve boyanın floresan olmasına izin verir.

İlaçla tedavi edilen hücreler, tedavi edilmeyen hücrelerden daha yüksek bir floresan sergiler, bu da ilacın makrofajların fagositik yeteneğini arttırmadaki etkinliğini düşündürür.

Metin protokolünde açıklandığı gibi, tam RPMI 1640 ortamında büyütülen murin makrofaj hücre hattının bir kültürü ile başlayın.

Ek olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi, PBS'de istenen konsantrasyona yeniden süspanse edilmiş bir Cryptococcus neoformans kültürü hazırlayın.

Kriptokok hücrelerini fagositoz boyası ile boyamak için, hücrelerin 999 mikrolitresini bir mikrosantrifüj tüpüne dağıtın. Tüpe 1 mikrolitre leke ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında, karanlıkta, yavaş çalkalama ile 1 saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücreleri önce santrifüjleme ile yıkayın. Ardından, süpernatanı atın. Hücreleri PBS ile yeniden süspanse edin ve yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.

100 mikrolitre Cryptococcus neoformans hücre süspansiyonunu, kültürlenmiş makrofajları içeren 96 oyuklu plakanın kuyucuklarına dağıtın.

Test ilaçlarının makrofaj fagositozu üzerindeki etkisini incelemek için, istenen test ilacının 100 mikrolitresini metin protokolünde açıklandığı gibi 96 oyuklu plakanın uygun kuyularına dağıtın.

Plakayı bir karbondioksit inkübatöründe 2 ila 6 saat inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, fagositik lekeden floresan ölçün.