Peptitlerin tuzdan arındırılması ve saflaştırılması için bir STAGE İpucu prosedürü

Minyatür bir saflaştırma sütunu olan STop And Go Extraction veya STAGE İpucu alın.

Uç, hidrofobik etkileşime dayalı peptit saflaştırması için uzun hidrokarbon zincirlerine bağlanmış küçük silika boncuklar içerir.

Reçine safsızlıklarını gidererek yüksek oranda asetonitril içeren tamponlarla yıkayın.

Optimum peptit bağlanması için kolonu dengeleyen bir bağlayıcı tampon ve santrifüj yerleştirin.

Peptit parçaları ve tuzlar dahil safsızlıklar içeren farklılaşmış nötrofil benzeri hücrelerden elde edilen önceden sindirilmiş bir peptit numunesi yükleyin.

Numuneyi kolondan geçirmek için santrifüjleyin. Peptit fragmanları, hidrofobik etkileşimler yoluyla hidrokarbon zincirlerine bağlanırken, tuzlar uzaklaştırılır.

Kalan safsızlıkları gidererek bağlayıcı tamponu ve santrifüjü ekleyin.

Elüsyon için yüksek asetonitril içeren tamponu tanıtın.

Bir şırınga kullanarak, tamponu kolondan geçirin. Asetonitril, hidrokarbon zincirlerine bağlanarak tampon ile elüte olan peptit parçalarının yerini alır.

Saflaştırılmış peptitleri tanımlamak için proteomik profil oluşturma yapın.

Başlamak için, her peptit numunesi için bir STop And Go Ekstraksiyonu veya STAGE ucu oluşturmak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucuna üç kat C18 reçinesi koyun.

1 x 10 hacim durdurma çözeltisi ekleyerek önceden inkübe edilmiş peptit örneklerinin enzimatik sindirimini durdurun. Numuneleri 13.200 rpm'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 2 mililitrelik tüpe aktarın.

Ardından, STAGE uçlarını 100 mikrolitre yüzde 100 asetonitril ile yıkayın ve STAGE uçlarını 1000 g'da 2 dakika veya tüm sıvı C18 reçinesinden geçene kadar santrifüjleyin.

50 mikrolitre Tampon B ile STAGE uç yıkamalarını ve ardından aynı santrifüj koşullarıyla 200 mikrolitre Tampon A ile tekrarlayın.

Numuneleri 1000 g'da 3 ila 5 dakika santrifüjlemek için STAGE uçlarına yükleyin. Daha sonra STAGE uçlarını 200 mikrolitre Tampon A ile 1000 g'da santrifüjleyerek 3 ila 5 dakika yıkayın.

Daha sonra, her bir STAGE ucuna 50 mikrolitre Tampon B ekleyin ve bir şırınga kullanarak, Tampon B içeren numuneleri 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne boşaltın.

Numuneler ayrıştırıldıktan sonra, peptitleri 45 dakika boyunca bir vakum santrifüjü kullanarak kurutun. Numuneleri, metin el yazmasında açıklanan koşullarla yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi üzerinde çalıştırın.

Verileri proteomik profil oluşturma için işlemek için, kütle spektrometresinden elde edilen ham veri dosyalarını MaxQuant yazılımına yükleyin. Yazılımın tüm parametreleri ve ayarlamaları için metin el yazmasına bakın.

Global parametrelerde, Organizma Kimliğini, protein sayısını ve dosya indirme tarihini kaydeden Uniprot veritabanından indirilen dizi tanımlaması için Homo sapiens'in FASTA dosyasını içe aktarın.

İşlenecek bilgisayar çekirdeği sayısını ayarlayın ve Başlat'ı seçin. MaxQuant'ın tamamlanmasının ardından, veri depolarına yüklemek için gereken diğer dosyalarla birlikte bir 'Birleşik' klasör oluşturulur.

Verileri analiz etmek için 'proteingroups.txt'yi Perseus'a yükleyin ve tüm etiketsiz nicelik veya LFQ yoğunluk dosyalarını 'Ana' penceresine seçin. Yalnızca site tarafından tanımlanan kirleticileri, ters peptitleri ve peptitleri kaldırarak satırları filtreleyin ve verileri günlük₂(x) ile dönüştürün.

Her bir replikasyonda tespit edilen protein sayısını gözlemlemek için, sayısal bir Venn şeması oluşturun ve bir biyolojik numunenin tüm replikaları için aynı adı sağlayarak her numune için kategorik açıklamalar ayarlayın.

Replikaların yüzde 50'sinden fazlasında ve en az bir grup içinde tanımlanan protein ile satırları geçerli değere göre filtreleyin. LFQ için eksik değerleri değiştirmek için, normal dağılımdan atama gerçekleştirin.

'Bin', 'conf' ve 'annotation' klasörlerine txt.gz FASTA dosyası ekleyerek Perseus web sitesinden indirilen ek açıklama bilgilerini protein satırlarına ekleyin. Protein isimleri, gen isimleri ve gen ontolojisi gibi belirli terimleri getirin.

Matris artık tamamlanmıştır ve temel bileşen analizi grafikleri, ısı haritaları ve kategori zenginleştirme gibi araçlarda görselleştirilebilir. Test edilen koşullar arasında protein bolluğundaki önemli değişiklikleri belirlemek için istatistiksel testler yapın.