Fonksiyonel SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Değerlendirilmesi

Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 veya SARS-CoV-2'ye karşı değişen konsantrasyonlarda nötralize edici antikorlar içeren seri olarak seyreltilmiş insan serumu ile başlayın.

SARS-CoV-2 spike proteinleri içeren bir lipid çift tabakası içinde kapsüllenmiş lusiferaz RNA, integraz ve ters transkriptaz ile psödotiplenmiş virüsleri tanıtın.

Antikorlar, serum seyreltmesine dayalı olarak virüsleri nötralize eder, daha düşük seyreltmeler maksimum nötralizasyon gösterir.

Anjiyotensin dönüştürücü enzim-2 reseptörlerini veya ACE2 reseptörlerini ve transmembran proteaz serin-2 veya TMPRSS2 eksprese eden hedef hücreleri tanıtın.

Daha yüksek serum dilüsyonlarında, nötralize edilmemiş virüsler ACE2 reseptörleri ile etkileşime girerken, TMPRSS2 spike proteinini parçalayarak virüs füzyonunu sağlar.

Girişten sonra, lusiferaz RNA, konakçı genomuna entegre olan ve lusiferaz enzimi üreten DNA'ya ters kopyalanır.

Ortamı, lusiferaz substratı ve bir lizasyon maddesi içeren bir tahlil tamponu ile değiştirin.

Hücreler parçalanır, substrat ile etkileşime giren ve yüksek lüminesans üreten hücre içi lusiferaz salgılar.

Viral nötralizasyon yüzdesini belirlemek için serum seyreltmeleri boyunca lüminesansı ölçün - yüzde elli nötralizasyona ulaşan seyreltme, nötralizasyon titresini temsil eder.

Başlamak için, yüzde 10 FBS ve yüzde 1 Penisilin-Streptomisin içeren 50 mikrolitre DMEM'i B'den H'ye, beyaz 96 oyuklu bir plakanın 1 ila 12 sütunlarına ekleyin.

Yüzde 10 FBS ve yüzde 1 Penisilin-Streptomisin içeren toplam 100 mikrolitre DMEM hacminde, A satırı, sütun 2 ila 10'un kuyularına 5 mikrolitre nekahet serumu ekleyin. Kontrol olarak A11 ve A12 kuyularına 5 mikrolitre pozitif ve negatif antiserum ekleyin.

A sırasının kuyucuklarından 50 mikrolitre çözeltiyi çıkarın ve altındaki tüm kuyucukların iki kat seri seyreltmesini gerçekleştirin. Her seyreltme için, hava kabarcıkları oluşturmadan yukarı ve aşağı pipetleyerek çözeltileri 5-10 kez karıştırmak için çok kanallı bir pipet kullanın.

Seri seyreltmeyi tamamladıktan sonra, son 50 mikrolitreyi her sütunun son kuyusundan atın.

Kuyu duvarlarında sıvı kalmadığından emin olmak için plakayı dakikada 500 devirde 1 dakika santrifüjleyin. Metin el yazmasında açıklandığı gibi SARS-CoV-2 PV'yi seyreltmek için gereken DMEM miktarını hesaplayın.

Seyreltilmiş PV çözeltisini bir pipet havzasında karıştırın ve yalnızca hücre kontrolünü içeren A6 ila A12 kuyuları hariç, her bir oyuğa 50 mikrolitre alikot edin. A1 ila A6 kuyuları, yalnızca PV kontrolü olarak hizmet eder.

Kuyu duvarlarında virüs kalmamasını sağlamak için plakayı dakikada 500 dönüşte 1 dakika santrifüjleyin. Ardından, serumun SARS-CoV-2 glikoproteini ile bağlanmasına izin vermek için plakaları 37 santigrat derecede yüzde 5 karbondioksit ile 1 saat inkübe edin.

Daha sonra, ACE2 ve TMPRSS2 plazmitleri ile 24 saat önce transfekte edilmiş HEK 293T / 17 hedef hücrelerinden oluşan bir plaka hazırlayın. Kültür ortamını plakadan çıkarın ve hücre ayrılmasını önlemek için tabağın bir tarafına ekleyerek 2 mililitre PBS ile iki kez yıkayın.

PBS'yi atın ve plakaya 2 mililitre tripsin ekleyin. Hücreler ayrılana kadar plakayı bir inkübatöre yerleştirin.

Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsin aktivitesini söndürmek için plakaya yüzde 10 FBS ve yüzde 1 Penisilin-Streptomisin içeren 6 mililitre DMEM ekleyin ve hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin.

Otomatik bir hücre sayacı kullanarak veya oda slaytını sayarak hücreleri sayın. Her bir oyuğa toplam 50 mikrolitre hacminde aliquoted 1 x 10⁴ hücre ekleyin ve plakayı 48 ila 72 saat boyunca yüzde 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, kültür ortamını tüm oyuklardan çıkarın ve 25 mikrolitre 1: 1 PBS karışımı ve ticari bir lusiferaz tahlil reaktifi ekleyin. Mikroplaka luminometreli ticari bir lusiferaz tahlil sistemi kullanarak plakayı okuyun.

Luminometre tarafından üretilen ham verileri kullanarak, metin el yazmasında açıklandığı gibi IC50 nötralize edici antikor titrelerini hesaplayın.