JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 4:51 dk. • July 8th, 2025
Bir test aşısı ile kaplanmış çok kuyulu bir plaka ile başlayın ve spesifik olmayan etkileşim bölgelerini bloke edin.
Test aşısı enjekte edilen bir fareden bir serum örneği alın.
Bu serum, test aşısını tanıyan immünoglobulin G veya IgG antikorları içerir.
Aşı kaplı kuyucuklara seri olarak seyreltilmiş serum örnekleri ekleyin.
IgG'ler aşıya bağlanır. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.
IgG'lere bağlanan peroksidaz konjuge ikincil antikorları ekleyin. Bağlanmamış ikincil antikorları çıkarın.
Kromojenik bir substrat ekleyin. Peroksidaz, substrat ile etkileşime girerek mavi renkli bir ürün oluşturur.
Reaksiyonu durdurmak için bir asit ekleyin. PH'daki değişiklik çözeltiyi sarıya çevirir.
Bir spektrofotometre kullanarak, serum örneğindeki IgG konsantrasyonunu belirlemek için her bir oyuğun renk yoğunluğunu ölçün.
Enzime bağlı immünosorbent testinin veya ELISA plakasının antijen kaplaması için, HI protein antijenini kaplama çözeltisi ile mililitrede 10 mikrograma seyreltin ve ELISA plakasındaki oyuk başına 100 mikrolitre seyreltilmiş antijen ekleyin. Plakayı gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, plakayı kuyucuk başına 300 mikrolitre PBST ile yıkayın.
Kuyucukları, 37 santigrat derecede iki saat boyunca oyuk başına 300 mikrolitre sızdırmazlık solüsyonu ile kapatın. Daha sonra, her deney grubundan üç mikrolitre fare serumunu 297 mikrolitre PBST ekleyerek 100 kez seyreltin ve seyreltilmiş serumu girdaplayın. Her serum numunesi için kaplanmış ELISA plakasına oyuk başına 100 mikrolitre seyreltilmiş serum ekleyin. Benzer şekilde, pozitif ve negatif kontrol serumlarını PBST ile 100 kez seyreltin, 396 mikrolitre PBST'ye 4 mikrolitre pozitif veya negatif kontrol serumu ekleyerek ve ardından girdap karıştırın.
Çift oranlı seyreltme gerçekleştirmek için, kaplanmış ELISA plakasının ilk sırasına önceden seyreltilmiş deneysel serumdan 200 mikrolitre ekleyin. Ardından, birinci ve 12. sıradakiler hariç tüm kuyucuklara 100 mikrolitre PBST ekleyin. Ardından, pipet tabancasını 100 mikrolitreye ayarlayın ve 100 mikrolitre serumu ilk sıradan PBST içeren ikinci sıraya aktarın.
Pipet tabancasını kullanarak ikinci sıradaki içeriği 10 kez karıştırın. Benzer şekilde, 11. sıraya kadar serumun 1:2 oranında art arda seyreltilmesini gerçekleştirin. İşiniz bittiğinde, 11. sıradan 100 mikrolitre sıvıyı atın.
Numune şablonunu takip ederek 12. satırdaki karşılık gelen her bir oyuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş negatif ve pozitif serum ekleyin. ELISA plakasını streç filmle kapatın ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Bu arada, PBST ekleyerek ikincil antikor anti-fare IgG HRP'yi 10.000 kez seyreltin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, bağlanmamış antikorları temizlemek için ELISA plakasını kuyu başına 300 mikrolitre PBST ile yıkayın. Daha sonra her bir oyuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve plakayı 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Plakayı kuyucuk başına 300 mikrolitre PBST ile yıkayın. Daha sonra her kuyucuğa 100 mikrolitre TMB renk geliştirme solüsyonu ekleyin. Plakaları 37 santigrat dereceye getirin ve 10 dakika boyunca ışıktan uzak tutun. Bundan sonra, reaksiyonu hemen 50 mikrolitre 2 molar sülfürik asit ile sonlandırın. Sonlandırmadan sonraki 15 dakika içinde bir enzim işaretleyici kullanarak 450 nanometrede optik yoğunluğu veya OD değerlerini tespit edin.