JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:34 dk • July 8th, 2025
Kaspaz-3 dahil olmak üzere birden fazla kaspaz üreten virüs ile enfekte memeli hücreleri ile başlayın.
Kontrol kuyusuna bir büyüme ortamı ve test kuyucuğuna kaspaz-3 inhibitörü takviyeli bir ortam ekleyin.
Kontrol kuyusunda, kaspaz-3, viral çoğaltma için gerekli olan viral nükleoproteinleri ve konakçı proteinleri tanır ve bozar.
Test kuyusunda, inhibitör hücreye girerek kaspaz-3 aktivitesini inhibe eder ve protein bozulmasını önler.
Hücreleri plakadan çıkarın. Hücre içi proteinleri serbest bırakarak hücre lizizini indüklemek için bir parçalama reaktifi ve ısı ekleyin.
Proteinleri boyuta göre ayırmak için her iki numuneyi de bir SDS-poliakrilamid jel ve elektroforez üzerine yükleyin.
Elektroforezden sonra, jeli bir lekeleme zarına aktarın.
Membranı viral nükleoproteinlere ve konakçı proteinlere karşı birincil antikorlarla tedavi edin.
Florofor konjuge ikincil antikorlarla yıkayın ve kaplayın, birincil antikorlarla bağlanarak floresan bantlar oluşturun.
Test numunesindeki daha yüksek floresan, kontrole kıyasla kaspaz-3 aracılı viral ve konakçı protein bölünmesinin azaldığını gösterir.
Başlamak için, MDCK veya A549 hücrelerini 12 oyuklu bir hücre kültürü plakasında tohumlayın, hücreleri gece boyunca %5'lik bir karbondioksit atmosferi altında 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, eski kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve hücreleri her bir kuyucukta 1 mililitre serumsuz MEM ile iki kez yıkayın.
Daha sonra 400 mikrolitre influenza A virüsü aşısı ekleyerek hücreleri enfekte edin ve plakayı bir saat inkübasyon için yerleştirin. İnkübasyondan sonra, virüs aşısını çıkarın ve hücreleri MEM ile yıkayın. Her oyuğa 1 mililitre serumsuz MEM ekleyin ve hücreleri önceki adımda gösterildiği gibi inkübe edin.
24 saat sonra, hücreleri 1 mililitrelik bir şırınga pistonu ile kazıyarak hasat edin ve 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü oda sıcaklığında iki dakika boyunca 12.000 g'da santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın. Hücre peletini 250 mikrolitre fosfat tamponlu salin ve santrifüj ile yıkayın. Süpernatanı çıkarın ve 100 mikrolitre hücre lizis tamponu ekleyin. Girdap ile karıştırın.
Hücreleri tamamen parçalamak için tüpü 98 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Ardından, enfekte olmamış ve enfekte olmuş numunelerden eşit miktarda proteini standart SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile çözün. Elektroforezden sonra, protein jelini bir nitroselüloz veya PVDF membranına aktarın ve western blotlama yapın. Sahte muamele edilmiş ve inhibitör ile muamele edilmiş enfekte numune şeritlerindeki protein seviyelerini karşılaştırın.
Bu çalışma, virüsle enfekte olmuş memeli hücrelerinde viral nükleoproteinlerin ve konak proteinlerin yıkımında kaspaz-3'ün rolünü incelemektedir. Bir kaspaz-3 inhibitörü kullanılarak, kaspaz-3 aktivitesinin protein bölünmesi ve viral yayılım üzerindeki etkisinin aydınlatılması amaçlanmıştır.
Virüsle enfekte hücrelerde kaspaz aracılı protein parçalanması, konakçı-patojen etkileşimlerini anlamak ve antiviral ilaç keşfinde hedef doğrulaması yapmak için kritik bir mekanistik kontrol noktasını temsil eder. Kaspaz aktivitesinin ve inhibisyonunun kantitatif değerlendirmesi, yolak modülasyonuna ilişkin öngörüsel güveni artırır ve antiviral adayların risk ayarlı ilerlemesini destekler. Bu iş akışı, kaspaz aktivitesinin hem viral hem de konakçı protein stabilitesi üzerindeki fonksiyonel etkisini netleştirerek, biyofarma ekiplerinin erken keşif kararlarındaki riskleri azaltmasını sağlar.
Bu yöntem, antiviral Ar-Ge süreçlerinde mekanistik sorgulama ile assay geliştirme ve preklinik değerlendirme arasında köprü kurarak, erken keşif ve hedef doğrulama aşamalarına entegre olur.
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026