Bakteri hücrelerinde bir floresan antibiyotik probunun birikimini ölçmek için bir test

Bakteri örnekleri içeren tahlil tüplerini alın.

Test numunesinde, bakterilerin antibiyotik akış pompasını bloke etmek için inhibitör molekülleri ekleyin.

Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Bakteri hücrelerine giren florofor konjuge antibiyotik probları ekleyin.

Kontrol numunesinde, akış pompası, probları hücre dışı ortama ekstrüde eder.

İnhibitör ile muamele edilmiş numunede, tıkalı akış pompası probları dışarı atamaz ve birikmelerine neden olur.

Numuneleri santrifüjleyin. Hücre dışı problar içeren süpernatanı atın.

Bakteri hücre duvarını zayıflatmak için lizis tamponu ve ardından lizozim ekleyin.

Hücreleri parçalamak için donma-çözülme döngüleri, sonikasyon ve yüksek sıcaklığa maruz kalma gerçekleştirin.

merkezkaç. Süpernatanı bir filtre membranına aktarın.

Probları içeren süzüntüyü yıkayın ve toplayın.

Filtratın floresan yoğunluğunu ölçün.

İnhibitör ile tedavi edilen bakteri örneklerinde daha yüksek bir floresan yoğunluğu, hücre içi prob birikimine yol açan akış fonksiyonu kaybını gösterir.

Prob birikimi analizi için, bakteri suşlarının çizgi gliserol stoklarını 37 santigrat derecede bir gece inkübasyon için LB agar plakalarına dökün. Ertesi sabah, 37 santigrat derecede lizojeni et suyunda gece boyunca kültür için plakadan tek bir koloni seçin. Ertesi sabah, gece boyunca kültürü taze ortamda yaklaşık 50 kat seyreltin.

Kültür orta log fazına ulaştığında, bakterileri santrifüjleme ile peletleyin ve ortamı boşaltın. Bakterileri 1 mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve bakterileri tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve yıkanmış peleti PBS'de 600 nanometre ikilik bir optik yoğunluğa yeniden süspanse edin.

PBS'de 1 mililitre bakteriye 10.1 mikrolitre 10 milimolar CCCP ekleyin ve bakterileri 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, bakterileri santrifüjleme ile toplayın ve peleti PBS'de 1 mililitre 10 ila 100 mikromolar floresan antibiyotik çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.

37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreleri yıkama başına 1 mililitre soğuk PBS'de dört kez santrifüjleme ile yıkayın. Yıkamadan sonra, bakterileri 180 mikrolitre lizis tamponu ve 70 mikrolitre lizozim ile parçalayın.

37 santigrat derecede 30 dakika sonra, bakterileri sırasıyla 5 dakika ve 34 santigrat derecede eksi 78 derecede 15 dakika boyunca üç kez dondurun. Son dondurarak çözme turundan sonra, numuneyi 20 dakika boyunca sonikleştirin, ardından 65 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon yapın.

İnkübasyonun sonunda, parçalanmış numuneyi santrifüjleme ile toplayın ve tüp içeriğini 10 kilodaltonluk bir filtre zarından süzün. Filtreyi yıkama başına 100 mikrolitre su ile dört kez yıkayın ve her yıkamayı siyah düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına ayırın. Ardından, florofora uygun uyarma ve emisyon dalga boylarına sahip bir plaka okuyucuda floresan yoğunluğunu ölçün.