Bakteri hücrelerinde bir floresan antibiyotik probunun birikimini ölçmek için bir test

Bakteri örnekleri içeren tahlil tüplerini alın.

Test numunesinde, bakterilerin antibiyotik akış pompasını bloke etmek için inhibitör molekülleri ekleyin.

Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Bakteri hücrelerine giren florofor konjuge antibiyotik probları ekleyin.

Kontrol numunesinde, akış pompası, probları hücre dışı ortama ekstrüde eder.

İnhibitör ile muamele edilmiş numunede, tıkalı akış pompası probları dışarı atamaz ve birikmelerine neden olur.

Numuneleri santrifüjleyin. Hücre dışı problar içeren süpernatanı atın.

Bakteri hücre duvarını zayıflatmak için lizis tamponu ve ardından lizozim ekleyin.

Hücreleri parçalamak için donma-çözülme döngüleri, sonikasyon ve yüksek sıcaklığa maruz kalma gerçekleştirin.

merkezkaç. Süpernatanı bir filtre membranına aktarın.

Probları içeren süzüntüyü yıkayın ve toplayın.

Filtratın floresan yoğunluğunu ölçün.

İnhibitör ile tedavi edilen bakteri örneklerinde daha yüksek bir floresan yoğunluğu, hücre içi prob birikimine yol açan akış fonksiyonu kaybını gösterir.

Prob birikimi analizi için, bakteri suşlarının çizgi gliserol stoklarını 37 santigrat derecede bir gece inkübasyon için LB agar plakalarına dökün. Ertesi sabah, 37 santigrat derecede lizojeni