Bir Fare Modelinden Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin İzole Edilmesi

Bir fareye intraperitoneal olarak sentetik bir glikolipid enjekte ederek başlayın.

Antijen sunan hücreler veya APC'ler, glikolipidi içselleştirir ve klasik olmayan MHC molekülü CD1d yoluyla sunar.

APC'ler dalağa göç eder ve değişmez doğal öldürücü T hücreleri veya iNKT hücreleri ile etkileşime girerek iNKT hücre aktivasyonunu ve proliferasyonunu indükler.

Dalağı hasat edin. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için mekanik olarak ayrıştırın.

Hücreleri bir tüpe aktarın. Lenfositleri ayırmak için bir yoğunluk gradyan ortamı ve santrifüj ekleyin.

Lenfositleri toplayın. iNKT hücreleri ile etkileşime giren glikolipid antijen yüklü florofor etiketli CD1d tetramerleri ekleyin.

Bağlanmamış tetramerleri çıkarın. Tetramer bağlantılı floroforlara bağlanan manyetik mikro boncuklarla kaplayın.

Bağlanmamış boncukları çıkarın ve hücre süspansiyonunu manyetik bir sütuna yükleyin.

Manyetik alan altında, boncuk bağlı iNKT hücreleri, kalan hücreler içinden akarken kolonda tutulur.

Sütunu manyetik alandan çıkarın. iNKT hücrelerini elüte etmek için bir elüsyon tamponu ekleyin.

Normal DBA / 1 fareyi, vücut ağırlığının kilogramı başına 0.1 miligram dozajında, alfa-GalCer ile intraperitoneal olarak enjekte edin. Modellemeden üç gün sonra, anesteziden sonra, farenin dalağını izole edin. Dalağı 200 gözenekli bir elekte kesip öğüterek tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın. Hücre süspansiyonunu PBS ile yıkayın. 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Hücreleri 1 mililitre tam kan ve doku seyreltme solüsyonu ile yeniden süspanse edin. 3 mililitre fare lenfosit ayırma ortamı ekleyin ve ardından hücreleri oda sıcaklığında 300 kez g'de 20 dakika santrifüjleyin.

iNKT hücrelerini saflaştırmak için, 100 mikrolitre 4 santigrat derece PBS ile 10 ila 7 hücreyi yeniden süspanse edin. 10 mikrolitre alfa-GalCer yüklü CD1d Tetramer-PE ekleyin ve karanlıkta 15 dakika boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve 80 mikrolitre PBS'de tekrar süspanse edin. 20 mikrolitre anti-PE mikro boncuk ekleyin ve karanlıkta 20 dakika boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Bunları PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 500 mikrolitre PBS ile yeniden süspanse edin.

Sıralama sütununu MACS sıralayıcının manyetik alanına yerleştirin ve 500 mikrolitre PBS ile durulayın. Hazırlanan hücre süspansiyonunu sıralama sütununa ekleyin, akışı toplayın ve PBS tamponu ile üç kez durulayın. Manyetik alanı çıkarın ve sıralama sütununa 1 mililitre PBS tamponu ekleyin. Etiketli hücreleri toplama tüpüne sürmek ve saflaştırılmış iNKT hücrelerini elde etmek için pistonu sabit bir basınçta hızlı bir şekilde itin. Otomatik hücre sayacı ile sayın.