Katyonik Polimer Kullanılarak Doğal Öldürücü Hücrelerde Viral Transdüksiyonun Arttırılması

Doğal öldürücü veya NK hücrelerini ele alalım. Bir floresan proteini kodlayan viral enzimler ve mühendislik RNA molekülleri içeren lentivirüs vektörleri ekleyin.

Katyonik polimerler ekleyin ve hücreleri ve virüsleri çökeltin.

Polimerler hem virüs hem de hücre üzerindeki negatif yükleri nötralize ederek zar füzyonunu kolaylaştırır.

RNA, DNA'ya ters kopyalanır ve konakçı genomuna entegre edilir, bu da floresan protein ekspresyonunu sağlar.

Sitokin interlökin-2 veya IL-2 ile takviye edilmiş ortam ekleyin.

IL-2, transgen ekspresyonunu korurken NK hücre sağkalımını ve proliferasyonunu destekleyen hücre içi sinyallemeyi tetikler.

Karışımı, NK hücreleri üzerindeki spesifik immünoreseptörlere bağlanan ve onları antiviral sitokinleri serbest bırakmaları için tetikleyen antikorlarla kaplanmış bir kuyuya aktarın.

Polimerin sitokin üretimi üzerindeki etkisini değerlendirmek için salınan sitokinlerin miktarını belirleyin.

Nekrotik hücrelerin DNA'sını etiketlemek için floresan boyalar ekleyin.

Akış sitometrisini kullanarak, canlı hücreleri tanımlayın ve polimer kaynaklı transdüksiyonun verimliliğini ölçmek için floresan proteinin sinyalini nicelleştirin.

Fare veya insan birincil NK hücrelerini, 5, 10 ve 20 MOY'de ve polibren, protamin sülfat veya dekstran varlığında GFP lentivirüs süpernatanı ile mililitre ortam başına 0.5 x 10^5'te 24 oyuklu bir plakanın kuyularında askıya alın.

Plakaları 60 dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı boşaltmadan, hücreleri gece boyunca% 5.2 karbondioksit ile aşılanmış 37 santigrat derece inkübatörde kültürleyin. Hücreler 10 mililitre PBS ile yıkandıktan sonra, hücreleri yeniden süspanse etmek için IL-2 ile 2 mililitre RPMI 1640 ortamı kullanın.

Hücrelerin toplanmasından bir gün önce, 96 oyuklu yüksek protein emici polistiren plakaları mililitre başına 2.5 mikrogram anti-NKG2D monoklonal antikorlarla kaplayın ve plakaları gece boyunca oda sıcaklığında veya buzdolabında inkübe edin. Ertesi gün, her kuyuyu üç kez yıkamak için 100 mikrolitre PBS kullanın.

Önce plakalara hafifçe vurarak dönüştürülmüş NK hücrelerini hasat edin. Daha sonra 96 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 100 mikrolitre hücre ekleyin. Aktivasyondan 16 ila 18 saat sonra, süpernatanları toplamak için çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra, bir ELISA kitinden alınan rekombinant sitokinleri kullanarak, standart bir eğri oluşturun ve süpernatanttaki interferon-gama gibi sitokinleri nicelleştirin.

NK hücresinin canlılığını test etmek için, transdüksiyondan dört gün sonra, hücreleri iki kez 10 mililitre soğuk PBS ile yıkayın. Daha sonra hücreleri hasat edin ve onları boyamak için bir ek-V/7-amino-aktinomisin D kullanın. Dönüştürülmüş NK hücreleri arasındaki nekrotik hücrelerin yüzdesini belirlemek için akış sitometrisini kullanın ve verileri metin protokolüne göre analiz edin.