JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 2:57 dk. • July 8th, 2025
Yeşil floresan proteinleri kodlayan in vitro transkribe mRNA'ları içeren bir tüp ile başlayın.
mRNA, bağışıklık tepkisini önleyen ve mRNA stabilitesini artıran modifiye nükleotidler, 5-metil-sitidin trifosfat ve psödouridin trifosfat içerir.
mRNA'nın 5' ucu defosforile edilir ve makrofajlar üzerindeki örüntü tanıma reseptörleri tarafından tanınmasını önler.
mRNA'ya katyonik lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifi ekleyin, mRNA'nın elektrostatik etkileşimler yoluyla kapsüllenmesini kolaylaştırın ve bir kompleks oluşturun.
Lipid-mRNA komplekslerini, yapışmış fare türevli primer makrofajlar içeren çok kuyucuklu bir plakaya yerleştirin ve homojen karıştırma için hafifçe çalkalayın.
Makrofajlar, mRNA içeren kompleksi bir endozoma içselleştirir. Daha sonra kompleks endozomal zar ile birleşerek mRNA'ları hücre sitoplazmasına bırakır.
3' ucundaki poli-A kuyruğu, yeşil floresan proteinleri üretmek için protein sentezine uğrayan mRNA'yı stabilize eder.
Bir floresan mikroskobu altında, makrofajlar içindeki yeşil floresan, modifiye mRNA'larla başarılı transfeksiyonu önerir.
Önceden hesaplanmış mRNA transfeksiyon tamponu hacmini eksi mRNA transfeksiyon reaktifi ve mRNA'yı bir reaksiyon tüpüne ekleyerek transfeksiyona hazırlanın. mRNA stoğunu çözün ve tüpü çevirerek hafifçe karıştırın. Ardından, önceden hesaplanmış mRNA hacmini reaksiyon tüpüne ekleyin.
Reaksiyon karışımını ve mRNA transfeksiyon reaktifini girdaplayın ve döndürün, ardından uygun hacimde mRNA transfeksiyon reaktifini reaksiyon karışım tüpüne ekleyin. Tüpü girdaplayın ve döndürün, ardından oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bu arada, makrofajların kültür ortamını taze, ılık kültür ortamı ile değiştirin.
Transfeksiyon karışımının inkübasyonu tamamlandıktan sonra, karışımı makrofajları içeren plaka oyuklarına damla damla ve dışarıdan kuyunun ortasına doğru bir daire şeklinde ekleyin. Transfeksiyon karışımının düzgün dağılımını sağlamak için, plakayı dikey ve yatay yönde hafifçe sallayın.
Daha sonra plakayı en az altı saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. İnkübasyondan sonra, floresan mikroskobu, akış sitometrisi veya immünoblot ile transfeksiyon verimliliğini analiz edin.
Bu prosedürün en önemli kısmı, tüm makrofajların aynı miktarda mRNA ile temas etmesi için transfeksiyon karışımının homojen dağılımını sağlamaktır.