JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:44 dk. • July 8th, 2025
İki elektroporasyon küveti alın. Bir küvet, otofajiyi indükleyen bir protein olan FIP200'ün üretimini engellemek için tasarlanmış küçük bir enterferans yapan RNA veya siRNA içerir.
İkinci küvet, FIP200 üretimini engellemeyen bir kontrol olarak karıştırılmış bir siRNA içerir.
Olgunlaşmamış dendritik hücreler veya iDC'ler ekleyin; siRNA'nın hücresel girişi için elektroporat yapın ve ardından hücreleri plakalayın.
İçselleştirilmiş siRNA, RNA'yı indükleyen bir susturma kompleksine bağlanır.
FIP200'e özgü siRNA'ya sahip kompleks, hedef mRNA'sını parçalayarak FIP200 üretimini inhibe ederken, kontrol siRNA ile muamele edilen iDC'ler FIP200 üretir.
Hücreleri toplayın ve herpes simpleks virüsünü ekleyin. Viral zarf-hücre zarı füzyonu üzerine, salınan DNA çekirdeğe girer ve viral proteinlerin ve nükleokapsidlerin üretimine yol açar.
Viral proteinler nükleer laminleri bozar. FIP200, bozulmuş laminlerin otofajisini indükleyerek onları bozunma için hedefleyen ve viral nükleokapsidlerin sitoplazmaya kaçmasını kolaylaştıran bir sinyal kaskadını tetikleyen bir kompleks oluşturur.
FIP200 üretiminin siRNA aracılı inhibisyonu, lamin otofajiyi kısıtlayarak nükleokapsid kaçışını önler.
Hücreler, siRNA'nın neden olduğu otofaji inhibisyonunu değerlendirmeye hazırdır.
Yapışmadan sonraki 3.5. günde, 12 milyon iDC'yi 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Onları 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın. Paralel olarak, olgunlaşma durumunu izlemek için akış sitometrik analizi yapın.
İDC'leri fenol kırmızısı içermeyen 5 mililitre OptiMEM'de nazikçe yıkayın ve 5 dakika boyunca 300 kez g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 200 mikrolitre OptiMEM içinde yeniden süspanse edin, hücre konsantrasyonunu 100 mikrolitre başına 6 milyon hücreye ayarlayın.
4 milimetre elektrot küvetlerine FIP200'e özgü veya karıştırılmış siRNA'dan 75 pikamole ekleyin ve 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu ilgili küvete aktarın. Bir elektroporasyon aparatı kullanarak iDC'leri doğrudan darbeleyin.
Elektroporasyondan sonra, iDC'leri önceden ısıtılmış taze DC ortamı ile altı oyuklu plakalara aktarın, hücreleri mililitre başına 1 milyon hücrelik bir nihai konsantrasyonda tohumlayın ve inkübatöre yerleştirin. 48 saat sonra, elektroporasyonlu iDC'lerin morfolojisini mikroskobik olarak inceleyin, ardından hücreleri bir hücre kazıyıcı ile toplayın ve bunları 15 mililitrelik tüplere aktarın.
Kuyucukları% 0.01 EDTA ile desteklenmiş 1 mililitre PBS ile durulayın ve çözeltiyi ilgili tüplere aktarın. Ardından, el yazmasında açıklandığı gibi her siRNA koşulu için hücreleri bölün.
Olgunlaşma durumunu ve hücre canlılığını değerlendirmek için 500.000 hücre kullanın. 200 spesifik knockdown verimliliğini doğrulamak için western blot analizi için 1 milyon hücre kullanın ve kalan hücreleri HSV-1 enfeksiyon deneyleri için kullanın.