Tümöre özgü kimerik antijen reseptör T hücreleri oluşturmak için bir ex vivo teknik

Primer dalak hücreleri ile karıştırılmış retroviral vektörleri ele alalım.

Vektörler, tümöre özgü bir antijeni hedef alan bir kimerik antijen reseptörünü veya CAR'ı kodlayan transgenik RNA içerir.

Ortamdaki sitokin interlökin-2, diğer hücreler sonunda ölürken, seçici olarak T hücresi proliferasyonunu teşvik eder.

Karışımı, rekombinant fibronektin fragmanları ile kaplanmış bir mikroplakaya aktarın.

Vektörleri ve T hücrelerini bağlayan fibronektin fragmanlarını kolaylaştırmak, virüs-konak hücre etkileşimine aracılık etmek için santrifüjleyin ve inkübe edin.

Vektörlerin zarfının hücre zarı ile füzyonu üzerine, viral enzimler salınan RNA'yı DNA'ya ters kopyalar ve onu konakçı genomuna dahil eder.

Transdüksiyonlu T hücreleri, antijene yanıt vermek için tümöre özgü antijeni ve hücre içi sinyal bölgelerini hedefleyen hücre dışı bir antikor değişken fragmanından oluşan yüzeye bağlı CAR'ları eksprese eder.

Hücreleri bir tüpe aktarmadan önce yeniden süspanse edin.

İçselleştirilmemiş virüsler içeren süpernatanı atmak için santrifüjleyin ve hücreleri aşağı akış tahlilleri için bir tamponda yeniden süspanse edin.

Splenektomiden sonraki gün, mililitre başına 25 mikrogram rekombinant insan Fibronektin fragmanı veya RHFF içeren PBS'yi hazırlayın ve her bir oyuğa 0.5 mililitre çözelti ekleyerek doku kültürü ile muamele edilmemiş 24 oyuklu plakaları kaplayın. Ertesi gün, çözeltiyi kuyucuklardan çıkarın ve PBS'de% 2 BSA'nın kuyu başına 1 mililitre ekleyin.

Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından yıkamak için 2 mililitre PBS eklemeden önce plakayı sıkıca yukarı kaldırarak BSA'yı çıkarın. Viral süpernatanı HEK293T hücrelerden topladıktan sonra, RHFF kaplı kuyucukların sayısına ve ayrıca 3 mililitreye eşit mililitre cinsinden nihai bir hacme taze TCM ekleyin.

Kültürlenmiş splenositleri inkübatörden çıkarın ve her bir oyukta iki ila üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonlarını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, viral süpernatanttaki splenositleri mililitre başına 1 x 10⁶ hücreye yeniden süspanse edin.

Daha sonra, RHFF kaplı plakaların kuyucuklarına splenosit süspansiyonunun oyuğu başına 1 mililitre ekleyin. Şimdi, plakaları 90 dakika boyunca 32 santigrat derece ve 770 gs'de 4 ivme ve sıfır kırma ayarı ile döndürün. Döndürme sırasında, TCM'de mililitre rekombinant insan IL-2 başına 50 uluslararası birim hazırlayın.

Döndürme işleminden sonra, plakaların her bir oyuğuna 1 mililitre orta ekleyin ve gece boyunca inkübe edin. T hücreleri% 80'den fazla birleşmeye ulaşırsa, hücreleri her bir oyukta iki ila üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek bölün, ardından her oyuktan 1 mililitreyi 24 oyuklu taze bir doku kültürü ile muamele edilmiş plakanın yeni oyuklarına aktarın.

Her kuyucuğa mililitre IL-2 başına 50 uluslararası birim olmak üzere 1 mililitre taze TCM ekleyin. Hücreler% 80'den fazla birleşmeye ulaşmazsa, her bir oyuğun üstünden 1 mililitre ortamı yavaşça pipetleyerek ve mililitre başına 50 uluslararası birim içeren 1 mililitre taze TCM ile değiştirerek ortamın yarısını değiştirin rekombinant insan IL-2.

Her bir oyukta üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek CAR T hücrelerini yeniden askıya alın ve 250 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 gs'de döndürün. Daha sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatanı tamamen aspire edin. Hücreleri yıkamak için PBS'yi kullanın, ardından ikinci kez yıkamadan önce sayın. Tipik bir CAR T hücresi verimi, oyuk başına yaklaşık 1 x 10⁶ hücredir.