JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 2:55 dk. • July 8th, 2025
T hücrelerinin bir süspansiyonu ile başlayın ve bunları kimerik antijen reseptörü veya CAR ve CRISPR lentivirüsleri için bir gen taşıyan CAR lentivirüsleri ile tedavi edin.
CRISPR lentivirus, kılavuz RNA ve Cas9 nükleaz için genlerin yanı sıra bir antibiyotik direnç geni içerir.
Hem CAR hem de CRISPR lentivirüsleri T hücreleri ile etkileşime girer ve RNA'larını serbest bırakır.
Bu RNA'lar ters kopyalanır ve T hücresi DNA'sına entegre olan karşılık gelen DNA'ya dönüştürülür.
Bu, CAR proteinlerinin, kılavuz RNA'ların ve Cas9 proteinlerinin sentezini sağlar.
Kılavuz RNA, T hücresi DNA'sındaki hedef geni spesifik olarak tanıyan ve ona bağlanan Cas9 ile bir kompleks oluşturur.
Bu arada, Cas9 DNA'yı parçalayarak çift sarmallı bir kırılma oluşturur.
Bu kırılma, hataya açık bir onarım mekanizması olan homolog olmayan uç birleştirme yoluyla onarılır ve hedef gen modifikasyonu ile sonuçlanır.
Bu, kimerik antijen reseptörleri ile genetik olarak değiştirilmiş T hücreleri üretir.
Değiştirilmemiş T hücrelerini ortadan kaldırmak için hücreleri antibiyotiklerle tedavi edin ve genetik olarak değiştirilmiş CAR T hücrelerini seçici olarak izole edin.
Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktörü bozmak için, el yazmasında açıklandığı gibi bir kılavuz RNA kullanın. Transfeksiyon reaktiflerini oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bunları %70 ila %90 birleşmeye ulaşan 293T hücrelerine ekleyin ve lentivirüs üretmek için transfekte edilmiş hücreleri 37 santigrat derece, %5 CO2'de kültürleyin.
24 ve 48 saatte, 50 mililitrelik ultrasantrifüj tüplerinde ultrasantrifüjleme yoluyla virüs içeren süpernatantı hasat edin ve konsantre edin ve ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede dondurun. Ardından, birinci gün, rozetleri parçalamak için T hücrelerini nazikçe yeniden askıya alın.
BSL-2 plus onaylı bir laboratuvarda, CAR T hücreleri oluşturmak için, uyarılan T hücrelerine CAR19 lentivirüsü ve GM-CSF hedefleyen CRISPR lentivirüsü ekleyin. Üçüncü ve beşinci günlerde, puromisin direnci taşıyan lenti-CRISPR ile düzenlenmiş T hücreleri için, hücreleri mililitre başına 1 mikrogram puromisin konsantrasyonunda puromisin dihidroklorür ile tedavi edin.