JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 2:30 dk • July 8th, 2025
Elektrik darbelerinin hücre zarında geçici gözenekler oluşturduğu bir süreç olan elektroporasyon için uygun bir ortamda asılı kalan T hücrelerini alın.
Bir Cas9 proteini ve tek bir kılavuz RNA veya sgRNA içeren kompleksler ekleyin. sgRNA, moleküler bir makas olan Cas9'u kesmek için DNA üzerinde belirli bir konuma yönlendiren küçük bir RNA'dır.
Cas9-sgRNA komplekslerinin hücreye taşınmasına yardımcı olan kısa tek sarmallı DNA molekülleri ekleyin.
Bu karışımı bir küvete aktarın ve kısa elektrik darbeleri uygulayarak elektroporasyonu başlatın.
Bu işlem komplekslerin hücreye girmesine izin verir.
sgRNA, T hücresi DNA'sındaki hedef bölgeye bağlanarak Cas9'un DNA'yı düzenlemesine izin vererek her iki iplikçikte de bir kırılma oluşturur.
Bu bozulma, onarım proteinlerini bölgeye bildirir.
Onarım proteinleri daha sonra uçları yeniden bağlayarak geni işlevsiz hale getirir.
Gen düzenlenmiş T hücrelerini, aşağı akış tahlilleri için uygun bir ortamda inkübe edin.
10 mikrogram Cas9 nükleazını 5 mikrogram tek kılavuz RNA ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek ribonükleoprotein veya RNP kompleksi hazırlayın. Tek kılavuz RNA'sı olmayan sahte bir kontrol ekleyin. Yeniden süspanse edilmiş T hücrelerini RNP kompleksi ile birleştirin ve 4.2 mikrolitre 4 mikromolar elektroporasyon arttırıcı ekleyin. İyice karıştırın ve elektroporasyon küvetlerine aktarın.
Nabız kodu EH-1-11 kullanarak hücreleri elektrolizle kaplayın. Daha sonra, 12 oyuklu plakalarda 48 saat boyunca 30 santigrat derecede mililitre insan IL-7 ve insan Il-15 başına beş nanogram ile desteklenmiş R-10'da mililitre başına 5 milyon hücreyi inkübe edin. İnkübasyondan sonra, T hücresi aktivasyonu ve genişlemesi ile devam edin.