Çift İnsanlaştırılmış BLT (Kemik İliği, Karaciğer, Timus) Fare Modeli Oluşturma

Bağışıklık hücrelerinden yoksun, anestezi uygulanmış, bağışıklık yetmezliği olan bir fare ile başlayın.

Kemik iliğindeki mevcut kök hücreleri ortadan kaldırmak için fareyi öldürücü olmayan bir dozda X-ışını ile tedavi edin.

Fareyi disseke edin ve böbrek ile kapsülü arasına insan fetal karaciğer ve timus dokusu parçalarını verin.

Kesi kapatın.

İmplante edilen karaciğer ve timus dokusu büyür ve bir organa benzeyen hücre agregatları olan organoidleri oluşturur.

İyileştikten sonra, insan hematopoetik kök hücrelerini veya HSC'leri kuyruk damarına enjekte edin.

Enjekte edilen HSC'ler timus organoidine ve kemik iliğine göç ederek çeşitli insan bağışıklık hücrelerine farklılaşır.

Mevcut bağırsak mikroplarını öldürmek için fareye antibiyotiklerle takviye edilmiş su sağlayın.

Oral bir tüp kullanarak, mikrobiyal kolonizasyonu teşvik etmek için insan dışkı mikroplarını doğrudan farenin bağırsağına sokun.

Bu, bir insan bağışıklık sistemi ve bağırsak mikropları içeren çift insanlaştırılmış bir BLT-fare modelinin geliştirilmesiyle sonuçlanır.

Karaciğer ve timus dokularını sol böbrek kapsülüne implante etmek için önce fareyi bir kapüşona yerleştirin. Ameliyat gününde, fareleri vücut ağırlığı dozunun gramı başına 12 santigrat gri renkte tüm vücut subletal ışınlama ile tedavi edin. Uygun bir sedasyon seviyesini onayladıktan sonra her fareyi sol, lateral ve medial tarafta tıraş edin. Hayvanın gözlerine oftalmik merhem sürün ve gerektiği gibi bir kulak küpesi uygulayın ve cildi üç ardışık iyot ve% 70 izopropanol ovma ile dezenfekte edin.

Deri hazırlandığında, 1 ila 1.6 milimetre küp insan fetal karaciğer dokusu parçasını bir trokara yüklemek için forseps kullanın, ardından 1 ila 1.6 milimetre küp insan fetal timus dokusu parçası izleyin. Cildi kaldırmak için forseps kullanın ve cilde küçük bir uzunlamasına kesim yapmak için bir neşter kullanın. Kesimi farenin sol tarafında 1,5 ila 2 santimetreye kadar uzatın ve kas tabakasını kaldırmak için forseps kullanın. Kas tabakasını uzunlamasına açmak için makas kullanın, böbreği açığa çıkarmak için kesimi gerektiği gibi uzatın ve böbreği çevreleyen yağ dokusunu nazikçe kavrayın.

Böbrek kapsülünün arka ucunda 1 ila 2 milimetrelik bir kesi yapmak için bir neşter kullanın ve önceden yüklenmiş trokarı böbreğin uzun eksenine paralel olarak yavaşça insizyona yerleştirin. Böbrek kapsülü ve böbrek arasındaki dokuları serbest bırakın ve böbrek ve bağırsağı normal pozisyonlarına geri getirin. Daha sonra kas tabakasını kapatmak için dikişler ve cildi kapatmak için cerrahi zımbalar kullanın. Fareyi, tamamen yaslanana kadar izleme ile otoklavlanmış bir mikro izolatör kafesine yerleştirin. Ameliyattan altı saat sonra, fareleri bir ısı lambasının altına yerleştirin ve masalları% 70 izopropanol ile dezenfekte edin.

200 mikrolitre PBS'de 1.5 ila 5 x 10⁵ CD34 pozitif insan fetal karaciğer dokusu izole hematopoietik kök hücreleri hayvan başına bir genişlemiş kuyruk damarına enjekte edin. Ardından, hafif bir basınçla kanamayı durdurun ve fareleri ev kafeslerine geri koyun. Ameliyattan 9 ila 12 hafta sonra, insanlaştırılmış bir farenin bir bacağını izole etmek için uygun boyutta bir plastik koni tutucu kullanın ve izole edilen bacağın medial tarafına% 70 izopropanol püskürtün. Toplama bölgesine antibiyotik ve ağrı giderici merhem sürün.

90 derecelik bir açıyla tutulan 25 gauge bir iğne kullanarak, 50 ila 100 mikrolitre kanı EDTA kaplı bir kan alma tüpüne toplamak için safen damarını delin. Uygun miktarda kan elde edildiğinde, fareyi kafesine geri döndürmeden önce kanamayı durdurmak için steril gazlı bez parçasıyla bölgeye baskı uygulayın. Daha sonra, insan CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 ve fare CD45'e karşı antikorlar kullanarak akış sitometrisi ile insan bağışıklık hücresi sulandırma seviyesini değerlendirmek için toplanan periferik kan örneğini kullanın.

Taze dışkı örneği toplamak için, tek tek otoklavlanmış kağıt torbaları bir çeker ocak içine yerleştirin ve her hayvan dışkı yapana kadar her torbaya bir fare yerleştirin. Ardından, fareleri kafeslerine geri koyun ve eksi 80 santigrat derece saklama için her bir dışkı örneğini fare başına 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için steril forseps kullanın.

14 günlük antibiyotik tedavisinin sonunda, içme suyunu otoklavlanmış sterilize suya değiştirin ve fareleri yeni bir otoklavlanmış kafese aktarın. Antibiyotiklerin kesilmesinden 24 ve 48 saat sonra, uygun şekilde hazırlanmış fekal mikrobiyota nakli materyali kaynaklarını doldurun ve numuneleri anaerobik koşullar altında anaerobik bir odada ayırın.

Dışkı nakli yapmak için, her deney hayvanına oral gavaj yoluyla 200 mikrolitre dışkı mikrobiyota nakli materyali verin ve kalan çözülmüş materyali insanlaştırılmış farelerin kürküne veya kafes yatağına yayın.