JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 4:22 dk. • July 8th, 2025
Bir CRISPR RNA veya crRNA ve trans-aktive edici bir crRNA veya tracrRNA karışımı alın.
Karışımı ısıtın ve soğumaya bırakın, bir kılavuz RNA veya gRNA oluşturmak için tracrRNA'nın crRNA ile baz eşleşmesini kolaylaştırın.
gRNA'ya bağlanan ve kompleksler oluşturan Cas9 enzimleri adı verilen moleküler makasları ekleyin.
Cas9-gRNA komplekslerini, bir elektroporasyon çözeltisinde süspanse edilmiş Doğal Öldürücü veya NK hücrelerine ekleyin.
Cas9-gRNA komplekslerinin taşınmasına yardımcı olan tek sarmallı DNA moleküllerini tanıtın.
Karışımı bir küvete aktarın ve komplekslerin hücreye girmesi için zarda geçici gözenekler oluşturarak elektroporasyon gerçekleştirin.
gRNA, genomdaki hedef bölgeye bağlanarak Cas9'un DNA'yı parçalamasına izin verir.
Onarım proteinleri kırılma bölgesinde bağlanır ve DNA'ya katılır, bu da genellikle baz çifti ekleme veya silme hatalarına neden olur. Ortaya çıkan modifikasyon, hedef geni bozar ve onu işlevsiz hale getirir.
Genetiği değiştirilmiş hücreleri daha fazla analiz için uygun bir ortama aktarın.
Elektroporasyon gününde, bir T25 şişesini, deneysel hücre koşulu başına mililitre başına 100 IU IL-2 ile takviye edilmiş 8 mililitre taze kültür ortamı ile doldurun
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin