JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 4:22 dk • July 8th, 2025
Bir CRISPR RNA veya crRNA ve trans-aktive edici bir crRNA veya tracrRNA karışımı alın.
Karışımı ısıtın ve soğumaya bırakın, bir kılavuz RNA veya gRNA oluşturmak için tracrRNA'nın crRNA ile baz eşleşmesini kolaylaştırın.
gRNA'ya bağlanan ve kompleksler oluşturan Cas9 enzimleri adı verilen moleküler makasları ekleyin.
Cas9-gRNA komplekslerini, bir elektroporasyon çözeltisinde süspanse edilmiş Doğal Öldürücü veya NK hücrelerine ekleyin.
Cas9-gRNA komplekslerinin taşınmasına yardımcı olan tek sarmallı DNA moleküllerini tanıtın.
Karışımı bir küvete aktarın ve komplekslerin hücreye girmesi için zarda geçici gözenekler oluşturarak elektroporasyon gerçekleştirin.
gRNA, genomdaki hedef bölgeye bağlanarak Cas9'un DNA'yı parçalamasına izin verir.
Onarım proteinleri kırılma bölgesinde bağlanır ve DNA'ya katılır, bu da genellikle baz çifti ekleme veya silme hatalarına neden olur. Ortaya çıkan modifikasyon, hedef geni bozar ve onu işlevsiz hale getirir.
Genetiği değiştirilmiş hücreleri daha fazla analiz için uygun bir ortama aktarın.
Elektroporasyon gününde, bir T25 şişesini, deneysel hücre koşulu başına mililitre başına 100 IU IL-2 ile takviye edilmiş 8 mililitre taze kültür ortamı ile doldurun ve şişeleri nemlendirilmiş 37 santigrat derece ve% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
Ortam dengelenirken, 26 mikrolitre transdüksiyon karışımı başına 3 ila 4 x 106 hücre ekleyin, konik bir tüpe ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Daha sonra, tüm FBS'yi hücre süspansiyonlarından çıkarmak için hücreleri yıkama başına 12 mililitre steril PBS'de üç kez yıkayın.
Hücreler yıkanırken, her bir CRISPR RNA'sını ve izleyici RNA'yı 200 mikromolar nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin. Her bir CRISPR RNA'nın 2.2 mikrolitresini numune başına 200 mikromolar hacimde bir izleyici RNA ile karıştırın ve numuneleri 95 santigrat derecede 5 dakika ısıtın. Ardından, numunelerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve CRISPR RNA - izleyici RNA komplekslerini kullanımlarına kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Ribonükleoprotein komplekslerini oluşturmak için, 30 ila 60 saniye boyunca dönen uygun karşılık gelen CRISPR RNA - izleyici RNA kompleksine Cas9 endonükleaz ekleyin ve elde edilen Cas9 ribonükleoprotein komplekslerini oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika inkübe edin.
Son yıkamadan sonra, Nükleofektör çözeltisi P3 kitinden tüm elektroporasyon takviyesi hacmini ekleyin ve hava kabarcıklarını önlemeye dikkat ederek her bir hücre peletini 20 mikrolitre P3 birincil 4D-Nükleofektör çözeltisinde yeniden süspanse edin.
Hemen uygun hücre süspansiyonuna her bir ribonükleoprotein kompleksinden 5 mikrolitre ekleyin ve Cas9 ribonükleoprotein kompleksi hücre karışımına 1 mikrolitre 100 mikromolar Cas9 elektroporasyon arttırıcı ekleyin. 26 mikrolitre Cas9 ribonükleoprotein hücre çözeltisini bir Nükleoküv Şeridinin ayrı oyuklarına aktarın ve numunelerin her bir oyuğun dibini kapladığından emin olmak için şeride hafifçe vurun.
Ardından, 4D-Nükleofektör sistemi EN-138 programını başlatın. Transdüksiyonun sonunda, hücrelerin üç dakika dinlenmesine izin verin. Ardından, her küvete 80 mikrolitre önceden dengelenmiş kültür ortamı ekleyin ve numuneleri 37 santigrat derece inkübasyonda koşul başına bir şişeye nazikçe aktarın.