Aşılar için Rekombinant Canlı Zayıflatılmış İnfluenza Virüslerinin Üretilmesi

Soğuğa adapte olmuş bir influenza suşunun belirli viral esansiyel proteinlerini kodlayan cDNA taşıyan çift yönlü plazmitlerle başlayın.

Farklı bir influenza suşundan hemaglutinin ve modifiye nöraminidaz cDNA içeren yeni bir çift yönlü plazmit setini tanıtın.

Bu karışıma bir transfeksiyon reaktifi ekleyin ve plazmitlerle bir kompleks oluşturmak için inkübe edin.

Hücreye plazmit girişini sağlamak için bu kompleksleri kültürlenmiş insan epitel benzeri hücrelere aktarın.

Zıt yönelimlerde iki promotöre sahip çift yönlü plazmitler, viral proteinlerin ve bunlara karşılık gelen RNA'nın üretimini sağlar.

Hücreleri daha düşük bir sıcaklıkta inkübe edin.

Viral proteinler ve viral RNA'lar, daha sıcak koşullarda daha az replikasyon ile soğuğa adapte olmuş rekombinant influenza virüsleri oluşturmak için kendi kendine birleşir.

Sialik asit aşırı eksprese eden MDCK hücreleri ve viral bağlanma ve hücrelerin içine girmeye izin veren modifiye tripsin enzimleri ile kaplama.

Yeni virüslerin replikasyonunu ve üretimini indüklemek için aynı sıcaklıkta inkübe edin.

Bir aşı hazırlığı için hazır olan rekombinant canlı zayıflatılmış influenza virüslerini santrifüjleyin ve hasat edin.

Başlamak için, %10 fetal sığır serumu ve% 1 kalem streptokok içeren DMEM ile 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir milyon 293T hücre yerleştirin. Daha sonra, kuyucuk başına 100 mikrolitre için yeterli plazmid transfeksiyon karışımı hazırlayın. Her plazmidin bir mikrogramını birleştirin ve tüpü önceden ısıtılmış Opti-MEM hücre ortamı ile 50 mikrolitreye kadar doldurun. Başka bir tüpe, transfekte edilecek toplam plazmit miktarına karşılık gelen 2000 hacminin iki katını ekleyin ve tüpü Opti-MEM ile 50 mikrolitreye kadar doldurun.

Transfeksiyon karışımını hücrelere eklemeden önce, oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Daha sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitre transfeksiyon karışımı ekleyin ve plakayı 16 saat boyunca bir inkübatöre taşıyın. Ertesi gün, ortamı %0,3 BSA ve %1 kalem strep ile DMEM olarak değiştirin. Sonra. hücreleri beş saat boyunca% 33 karbondioksit ile 5 santigrat dereceye taşıyın.

Beş saat sonra, tripsin takviyeli DMEM'de bir milyon influenza izin veren MDCK hücresinin bir kaplamasını ekleyin. Virüsü oluşturmak ve çoğaltmak için ko-kültürleri 33 santigrat derece inkübasyon rejimi altında 2 ila 3 gün koruyun. Daha sonra, beş dakikalık 260 g'lık bir dönüş kullanarak kalıntıları temizleyin, ardından süpernatanları toplayın.