Name: Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Öğrenin, bitki genlerinde histon modifikasyonlarını ChIP ve gerçek zamanlı PCR ile nasıl tespit edeceğinizi. Arabidopsis'te gen düzenlemesi ve stres yanıtlarını incelemek için güvenilir bir yöntem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<p class="jove_content"> Bu çalışma, Alman Bilim Vakfı (DFG) ve Alman federal ve eyalet hükümetleri Mükemmellik Girişimi tarafından finanse edildi. </p>

<p class="jove_title"> 1. Bitki materyali, Crosslinking </p><ol><li> Hasat 1-2g Arabidopsis 50 ml plastik tüp yaprak (6, 10 cm rozet çapa kadar) ve crosslinking tampon ile 40ml kadar doldurmak. </li><li> Yaprakları, tampon yüzeyi üzerinde özel bir filtre süngeri sağ doldurma, örneğin dalmış muaftır emin olun. Sonra bir desikatöre tüpler yerleştirin. </li><li> Vakum 10dk sızmak. Crosslinking durdurmak için her tüp 2M glisin 2.5ml eklemek ve glisin eşit dağılımını garanti tüpler ters. </li><li> Vakum başka bir 5min sızmak ve bir elek üzerinde yaprakları hasat sırasında sıvı atın. </li><li> Yıkama 1L, sonra bir bardak beher su, kağıt havlu ile iyice kuru yapraklar ile iki kez bırakır. </li><li> Taze bir plastik tüp yaprakları toplayın ve sıvı nitrojen içinde dondurarak. Mağaza -80 ° C kadar kromatin izolasyon bırakır. </li></ol><p class="jove_title"> 2. Kromatin izolasyonu </p><ol><li> Yapraklar kullanana kadar sıvı azot tutuldu harç ve dişilik organı ile zemin. </li><li> 50-ml plastik tüp toz transferi ve 30ml ekstraksiyon tamponu # 1 geçici olarak askıya. </li><li> Bir tepegöz çalkalayıcı 4 ° C'de 15 dakika inkübe. </li><li> 50-ml taze bir plastik tüp içine dört kat miracloth boyunca Filtrat süspansiyon. </li><li> 2.800 xg 20min için Spin 4 ° C </li><li> Süpernatantı ve 1 ml tampon ekstraksiyon # 2 fırça ile pelet askıya. İlk tampon # 2 küçük bir hacim eklemek, sonra pelet bir boya fırçası ile askıya alma ve sonra tampon geri kalanını ekleyin. </li><li> 4 12,000 xg'de 10 dakika süreyle bir 1.5mL mikrofuge'ye tüp ve spin süspansiyon transfer ° C </li><li> Bu arada, 1.5mL ekstraksiyon tamponu # 3 içeren 2mL mikrofuge'ye tüpleri hazırlayın. </li><li> Bükülmüş tüp (adım 2.7) süpernatantı ve ekstraksiyon tamponu # 3 300μL pelet askıya. İlk olarak, tampon # 3 küçük hacimli bir boya fırçası ile pelet askıya, ve sonra geri kalan tampon eklemek. </li><li> Dikkatle pipetlemeyin adım 2.8 'de hazırlanan 1,5 mL tampon ekstraksiyon # 3 üst pelet (adım 2.9) askıya aldı. Iki faz karışımı olmayacak emin olun. 4 16.000 xg'de 1s için Spin ° C. </li><li> Süpernatantı ve sonication tampon 300μL bir boya fırçası ile kromatin pelet askıya. </li><li> DNA boyutu yaklaşık 400bp Sonotrode ile ya da ultrasonik banyoda kromatin sonikasyon. Sonicating zaman, emin kromatin yaklaşık 30 üzerinde ısıtılır ° C ısıya duyarlı çapraz bağları korumak için olun. Sonication süresi farklı sonication cihazlar arasında önemli ölçüde farklılık gösterir, çünkü deneysel olarak belirlenir. Rehberlik için, iki farklı aygıtlar için ayarları verilmiştir: </li></ol><p class="jove_content"> 0.6mL mikrofuge'ye tüp Bandelin marka Sonotrode maruz kromatin% 25 güç, çevrim = 50 ayarları ile beş kez 20 patlamaları ile sonication. Bunu yaparken, bir buz banyosunda her 20 <sup>inci</sup> patlamaları sonra serin bir örnek . </p><p class="jove_content"> Diagenode Bioruptor ultrasonik banyo ile sonication için, su banyosu ve buz ile doldurun ve 'yüksek' ayarı ile 1.5mL mikrofuge'ye tüpler 30 saniye on kat sonikasyon. Her 30 saniye sonra, başka bir 30 saniye boyunca serin örnekleri. </p><ol start="13"><li> Spin 4 16.000 g 5min için örnek sonicated ° C çözünmemiş malzeme hızlandırabilir. Süpernatant doğrudan immunoprecipitation için kullanılabilir. Alternatif olarak, numuneler, sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C ye kadar daha fazla kullanım saklanan şok olabilir. </li></ol><p class="jove_title"> 3. Immunoprecipitation </p><ol><li> 40μL protein-A antikor bağlayıcı tampon agaroz ve 1.8mL. Içeren 2 ml mikrofuge'ye tüpleri hazırlayın Kromatin hazırlık 200μL (adım 2.13) ekleyin. </li><li> Havai bir çalkalamalı 1s tüpleri inkübe edin. </li><li> Protein-A agaroz boncuk atın ve immunoprecipitation için supernatant kullanabilirsiniz. </li><li> Kromatin konsantrasyonu ('input') belirlemek için bir 40μL-kısım çıkarın. </li><li> 30μL protein-A agaroz ve 400μL sonicated kromatin süspansiyon özgü reaktifler ve teçhizat aşağıdaki tabloda belirtilen değişiklik-spesifik antikor miktarı. </li><li> Bir tepegöz çalkalayıcı 2.5h veya gece boyunca inkübe 4 ° C </li><li> 440 x g. 2min için boncuk aşağı Spin </li><li> Boncuk pelet 900μL (aşağıdaki listeye bakın) her yıkama tamponu ile yıkayın. Her tampon için, bir havai çalkalayıcı 4 ° C, 10 dakika süreyle tampon inkübe boncuk, sonra 440 xg'de 2min dönmeye supernatant atın ve bir sonraki tampon eklemek. <ol><li> Düşük tuz yıkama tamponu </li><li> Yüksek tuz yıkama tamponu </li><li> LiCl yıkama tamponu </li><li> Te yıkama tamponu </li></ol></li><li> Son yıkamadan sonra, kalan herhangi bir tampon tamamen kaldırmak. </li></ol><p class="jove_title"> 4. Histon ve DNA De-crosslinking ve çöktürülmüş DNA saflaştırılması </p><ol><li> Agaroz pelet ve 3.4 adım 40μl 'giriş' örnek bir vorteks karıştırıcı 5min için karışımı, spin örnekleri ve incu de crosslinking tampon 100μL ekle65 ° C gecede kesilmek. </li><li> Ticari bir DNA veya PCR saflaştırma kiti ile DNA arındırın. </li><li> Genellikle son sütun eluat 01:05 seyreltme 5μl gerçekleştirmek için yeterli geleneksel lokus spesifik gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR (RT-qPCR). </li></ol><p class="jove_title"> 5. Tamponların Tablosu </p><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Crosslinking tampon</strong> </td></tr><tr><td> Sodyum bütirat </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> Formaldehit </td><td> % 3 (v / v) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Ekstraksiyon tamponu # 1</strong> </td></tr><tr><td> Sodyum bütirat </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> Komple proteaz inhibitörü </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Ekstraksiyon tamponu # 2</strong> </td></tr><tr><td> Sodyum bütirat </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (w / v) </td></tr><tr><td> Komple proteaz inhibitörü </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Ekstraksiyon tamponu # 3</strong> </td></tr><tr><td> Sodyum bütirat </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 0,15 (w / v) </td></tr><tr><td> Komple proteaz inhibitörü </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Sonikasyon tampon</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 25mm </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> % 0.5 (w / v) </td></tr><tr><td> Komple proteaz inhibitörü </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Antikor bağlanma tampon</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 50mm </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 0,1 (w / v) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Düşük tuz yıkama tamponu</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> % 0,1 (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Yüksek tuz yıkama tamponu</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 500mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> % 0,1 (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>LiCl yıkama tamponu</strong> </td></tr><tr><td> Lityum klorür </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> Nonidet-P40 </td><td> % 1 (v / v) </td></tr><tr><td> Sodyum desoxycholate </td><td> % 1 (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Te yıkama tamponu</strong> </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Decrosslinking tampon</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 6.8 </td><td> 62.5mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 200mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> % 2 (w / v) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 10mM </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> 6. Temsilcisi sonuçları: </p><p class="jove_content"> <em>Arabidopsis thaliana PR2</em> savunma gen ekspresyonu bir β kodlamaAntimikrobiyal aktivite <sup>12,</sup> 1,3-Glukanaz benzothiadiazole (BTH), bitki hormonu salisilik asit <sup>3</sup> sentetik bir analog tarafından sağlandı. <strong>Şekil 1</strong> <em>PR2</em> ifade aktivasyonunun gösterir histon lizin kalıntılarının asetilasyon bir artış ile ilişkili <em>PR2</em> organizatörü H3 ve H4. Nucleosome yoğunluğu <sup>13</sup> gen aktivasyonu sırasında azalır histon 3 değişmeyen bir bölge için bir antikor ile elde edilen sinyalin, histon asetilasyonu değerleri normalize edildi. </p><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"><br> <strong>Şekil 1 BTH Arabidopsis <em>PR2</em> organizatörü histon asetilasyonu neden olur.</strong> Bitkiler 100μM BTH veya ıslatılabilir toz kontrolü ile tedavi edildi. 72h sonra, yapraklar toplanmış ve kromatin izole edilmiştir. Asetilasyon özel antikorlar (resimde gösterildiği gibi) ile yağış sonrası elde edilen sinyal histon H3 değişmeyen bir etki alanı için bir antikor ile yağış elde sinyaline normalize edildi. Çöktürülmüş kromatin RT-qPCR tarafından belirlendi. Veri BTH tedavi yokluğunda histon değişiklik seviyeleri için standardize edilmiştir. </p>

<ol><li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>3</strong>, 224-229 (2002).</li>
<li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3%3A+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <strong>25</strong>, 15-30 (2007).</li>
<li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>12</strong>, 50-55 (2011).</li>
<li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 119-132 (2006).</li>
<li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>141</strong>, 1078-1088 (2006).</li>
<li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>143</strong>, 1660-1668 (2007).</li>
<li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+GCN5%2C+HD1%2C+and+TAF1%2FHAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 2893-2903 (2006).</li>
<li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+techniques+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em>Plant Journal</em>. <strong>39</strong>, 776-789 (2004).</li>
<li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em>Trends Biochem. Sci</em>. <strong>25</strong>, 99-104 (2000).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em>Plant Meth</em>. <strong>3</strong>, 11-11 (2007).</li>
<li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em>Plant J</em>. <strong>53</strong>, 465-474 (2008).</li>
<li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>4</strong>, 645-656 (1992).</li>
<li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+displacement+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em>Genes Develop</em>. <strong>20</strong>, 2009-2017 (2006).</li>
</ol>

<p class="jove_content"> Çıkar çatışması ilan etti. </p>

<p class="jove_content"> Protokolde en kritik adımlar, DNA ve histon, yaprak malzemenin türü ve miktarı, malzemenin taşlama, ve kromatin sonication crosslinking. Bu konularda daha ayrıntılı bir tartışma için, refs bakın. 9 ve 10. </p><p class="jove_step"> Sonikasyon ve crosslinking: </p><p class="jove_content"> 400bp hakkında parçaları sonication sırasında kromatin bozmak için önemlidir. Ise yetersiz sonication uzun kromatin parçaları bırakacaktır kapsayan sonication, DNA ve histon bozarak kromatin yok edecektir. Distal histon modifikasyonları test lokus yerel değişiklikler ayırt edilemez, çünkü bu yöntemin özgüllüğü etkileyebilir. Sonikasyon verimliliği en iyi örneklerinden DNA izole ve uzunluğu makaslanmış DNA agaroz jel elektroforezi ile belirlenmesi, Sonikasyon, de-crosslinking DNA ve histon önce ve sonra 20μL kromatin toplayarak test edilir. Kromatin hazırlık hala parçalanmış DNA görselleştirme etkileyebilir arıtma bu aşamada, büyük miktarda RNA içerdiğinden RNAse elektroforez önce numuneleri eklenmelidir. Makaslanmış Kromatin DNA DNA 400bp etrafında maksimum sinyal yoğunluğu olmayan makaslanmış Kromatin DNA 10kbp daha uzunsa bir karalama formları ise örnekleri, kromatin immunoprecipitation için yararlıdır. </p><p class="jove_content"> Biz rutin olduğu gibi bırakır kromatin crosslinking için% 3 (v / v) formaldehit kullanır, ancak% 1 (v / v) formaldehit, çoğu durumda yeterli olabilir. Bizim ellerde, düşük formaldehit konsantrasyonları sonucu PCR reaksiyonlarında kısa sonication kez ve arka plan sinyalleri için izin verir. Ancak, yeterli miktarda formaldehit genellikle bağımsız deneyler arasındaki PCR sinyali düşük tekrarlanabilirlik. Bu düşük konsantrasyonlarda formaldehid ile yaprak yetersiz nüfuz etmesine bağlı olabilir. Bileşik süre ile polimerize eğilimi sık sık formaldehit hisse senedi alışverişi yapmak emin olun. Formaldehit çözümleri yalnızca yaklaşık bir ay boyunca stabildir ve bu dönemde pek metanol istikrar uzamıştır. Bu deneysel koşullar kurarken farklı formaldehit konsantrasyonları test etmek için tavsiye edilir. </p><p class="jove_step"> Bitki materyali ve taşlama miktarı: </p><p class="jove_content"> Yaprakların birbirine yapışmasını önlemek için tampon büyük bir hacim düşük miktarda yaprak malzeme sızmak için çok önemlidir. Yaprak formaldehit yetersiz infiltrasyonu genellikle sonuçları yapışmasını. Ayrıca, çok fazla bitki materyali miracloth doku gözenekleri bloke eder. Öğütme verimliliği önemli ölçüde mükemmel bir uyum ile bir havanda kullanarak bağlıdır. Biz rutin olarak ek sıvı azot yokluğunda bir sıvı azot soğutmalı havaneli ve harç ile öğütmek için üç kez 50 saniye kadar malzeme ince bir toz için zemin. </p>

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Protein-A-Agaroz </td><td> Roche </td><td> 11 134 515 001 </td><td> antikor sınıfı bağlıdır. </td></tr><tr><td> Protein-G-Agaroz </td><td> Roche </td><td> 11 243 233 001 </td><td> antikor sınıfı bağlıdır. </td></tr><tr><td> Anti-hyperacetyl-H4 </td><td> Millipore </td><td> 06-946 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H4K5 </td><td> Millipore </td><td> 07-327 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H4K8 </td><td> Millipore </td><td> 07-328 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H4K12 </td><td> Millipore </td><td> 07-595 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H4K16 </td><td> Millipore </td><td> 07-329 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H4K18 </td><td> Millipore </td><td> 07-354 </td><td> biz 1μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H3K9 </td><td> Millipore </td><td> 07-352 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H3K14 </td><td> Millipore </td><td> 07-353 </td><td> biz 1μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-trimetil-H3K4 </td><td> Diagenode </td><td> PAB-003-50 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-dimetil-H3K4 </td><td> Millipore </td><td> 07-030 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-monometil-H3K4 </td><td> Abcam </td><td> ab8895 </td><td> 2,5-10μL </td></tr><tr><td> Anti-H3 </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td><td> histon yoğunluğu kontrol etmek için 1μL kullanılan </td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200 </td><td></td></tr><tr><td> Sonotrode MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miracloth </td><td> Calbiochem </td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td> Komple proteaz inhibitörü </td><td> Roche </td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

bitki leaves histon değişiklik tespiti

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content"> Kromatin yapısı ökaryotlarda gen ekspresyonunun düzenlenmesi için önemlidir. Bu süreçte, histon H3 ve H4 amino-terminal kuyrukları kromatin remodeling, DNA metilasyon ve kovalent değişiklikler temel rolleri <sup>1-2</sup> oynamaktadır. H3 ve H4 histon modifikasyonları, lisin ve arjinin metilasyon, lisin asetilasyonun, serin <sup>kalıntıları</sup> 1-2 fosforilasyon içerir . Bu modifikasyonlar gen aktivasyonu, baskı ya da uygun sinyalleri (mikrop-ilişkili moleküler desenleri, ışık, hormonlar, vs.) <sup>3-7</sup> algı sonra ifade daha hızlı ve sağlam bir aktivasyon destekler gen astarlanmalıdır bir devlet ya ilişkilidir . </p><p class="jove_content"> Burada, biz, özel seçilmiş bitki genleri kromatin modifikasyonları güvenilir ve hassas tespiti için bir yöntem mevcut. Teknik değişiklik-spesifik antikorların <sup>9,10</sup> ile <sup>8,9</sup> formaldehit, ekstraksiyon ve kromatin, kromatin immunoprecipitation (ChIP) sonication (modifiye) histon ve DNA çapraz bağlanma dayalı, histon-DNA kompleksleri de-crosslinking gen belirli gerçek zamanlı kantitatif PCR. Yaklaşım, <sub>C</sub> 4 <sup>mısır</sup> 5,11 fotosentez ve <sup>Arabidopsis</sup> 3 sistemik bağışıklık ile ilgili özel histon modifikasyonları tespit için yararlı olduğu kanıtlanmıştır . </p>

<p class="jove_content">Özgü bitki genleri histon değişiklikleri algılamak için güvenilir ve faydalı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yaklaşım, kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve gerçek zamanlı kantitatif PCR birleştirir. Çeşitli fizyolojik süreçlerde bir rol ile spesifik genlerin histon modifikasyonları tespiti sağlar.</p>

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Kromatin yapısı, ökaryotlarda gen ekspresyonunun düzenlenmesi için önemlidir. Bu süreçte, kromatin yeniden şekillenmesi, DNA metilasyonu ve kovalent...

<p>Aşağıdaki yöntem, seçili bitki genlerindeki spesifik kromatin modifikasyonlarının güvenilir ve hassas bir şekilde tespitini sağlar. İlk olarak, modifiye histonlar ile DNA'yı formaldehit ile çapraz bağlayın. Ardından, modifikasyona özgü antikorlarla immünopresipitasyonu kolaylaştırmak için kromatini ekstrakte edin ve sonikasyon uygulayın.</p><p>Son olarak, histon DNA komplekslerinin çapraz bağlanması ve gene özgü gerçek zamanlı kantitatif PCR ile çip reaksiyonunu analiz edin. Bitkilerde bu yaklaşım, mısırdaki C4 fotosentezi ve Arabidopsis'teki sistemik bağışıklık ile ilişkili spesifik histon modifikasyonları gibi moleküler bilgiler sağlayabilir. Kromatin immünopresipitasyonunun, kütle spektrometresi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu tekniğin bitki genomundaki seçili diziler üzerindeki histon modifikasyonlarının tespitine olanak tanımasıdır.</p><p>Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, protokolün prosedürün başarısı için kritik öneme sahip birkaç adım içermesi nedeniyle zorlanacaklardır. Bu videoda, model bitki Arabidopsis ANA'da gen ekspresyonunun düzensizliğine dair bilgi sağlamak için chip analizini kullanıyoruz; prosedürü PhD öğrencisi Mic Yakovich uygulamaktadır. Her bir örnek için, iki gram Arabidopsis yaprağı hasadı ve 50 mililitrelik plastik bir tüp ile başlayın. 40 mililitre işaretine kadar crosslinking tamponu ile doldurun ve yaprakların daldırılmış halde kalmasını sağlamak için tampon yüzeyinin hemen üzerine özel bir filtre sünger yerleştirin.</p><p>Şimdi, örnekleri vakumlu bir desikatöre yerleştirin ve 10 dakika boyunca filtreleyin. Çapraz bağlanma reaksiyonunu durdurmak için 2,5 milliliters iki molar glisin ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Ardından beş dakika daha infiltre edin, vakuma devam edin ve beş dakika daha infiltre edin.</p><p>Ardından, yaprakları bir süzgeç üzerinde toplarken sıvıyı dökün. Yaprakları plastik bir beher içinde bir litre su ile iki kez yıkadıktan sonra, kağıt havlularla iyice kurulayın, yaprakları yeni bir plastik tüpe toplayın ve sıvı azot içinde dondurun. Örnekleri, kromatin izolasyonuna kadar -80 °C'de saklayın.</p><p>Sıvı azotla soğutulmuş bir havan ve havan eli kullanarak, dondurulmuş örnekleri ince bir toz haline gelinceye kadar öğütün. Tozu 50 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın. Tozu 30 mililitre bir numaralı ekstraksiyon tamponunda süspande edin ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde dört derece celsius'ta 15 dakika inkübe edin.</p><p>Süspansiyonu, dört kat ayna bezi üzerinden yeni bir 50 mililitrelik plastik tüpe aktarın. Santrifüjden sonra süpernatantı atın. Ardından, bir resim fırçası kullanarak peleti 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu 2 içinde yeniden süspanse edin ve son olarak 950 mikrolitre daha ekstraksiyon tamponu ekleyin.</p><p>İkinci olarak, süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu sırada, 1,5 mililitre ekstraksiyon tamponu içeren iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerini hazırlayın. Üçüncü adım.</p><p>Ardından, peleti kademeli olarak 300 microliters ekstraksiyon tamponunda süspand etmek için süpernatanları uzaklaştırın. Üç numara. Öncelikle, az miktarda tampon ekleyin.</p><p>Üçüncü olarak, peleti bir resim fırçasıyla süspande edin ve ardından geri kalan tamponu ekleyin. Şimdi örnekleri, önceden hazırlanmış 1,5 mililitre ekstraksiyon tamponu içeren tüplerin üzerine dikkatlice katmanlar halinde yerleştirin. Üç numara, iki fazın karışmadığından emin olarak örnekleri 4 °C'de 16.000 ×g hızda bir saat boyunca santrifüjleyin.</p><p>Süpernatantı atın ve kromatin peletini bir boya fırçasıyla 300 µL sonikasyon tamponu içinde süspande edin; kromatini yaklaşık 400 baz çifti DNA boyutuna gelene kadar sonike edin. Sonikasyon sırasında kromatinin yaklaşık 30 °C'nin üzerine çıkmadığından emin olun. Isıya duyarlı çapraz bağları korumak için, çözünmemiş materyalleri çöktürmek amacıyla sonike edilen örneği santrifüjleyin ve süpernatantı, protein agaroz ve antikor bağlama tamponu içeren 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.</p><p>Örnek kromatin hazırlığından 200 µL ekleyin. Tüpleri bir saat boyunca orbital çalkalayıcıda inkübe edin. Santrifüj işleminden sonra, örnek süpernatantlarını toplayın ve 30 µL protein aliquot edin.</p><p>Girdi materyalinin kromatin konsantrasyonunu belirlemek için taze 1,5 mililitrelik tüpler hazırlayın. Sonikasyona uğramış kromatinin 40 mikrolitresini ayırın. Ardından, sonikasyona uğramış kromatin süspansiyonunun 400 mikrolitresini 30 mikrolitre protein A boncuklarının ve uygun miktarda modifikasyona özgü antikorun üzerine ekleyip dört derece Celsius'ta, üstten sarsıntılı bir çalkalayıcıda gece boyunca inkübe edin.</p><p>Boncukları 440 ×g'de iki dakika boyunca santrifüj ederek toplayın. Süpernatantı uzaklaştırın ve boncuk peletlerini, bir orbital çalkalayıcı üzerinde ilgili tamponun 900 µL'si ile art arda 10 dakikalık yıkamalardan geçirin. Son yıkamadan sonra, kalan tüm tamponu tamamen uzaklaştırın. DNA'yı histonlardan ayırmak için, boncuklara 400 µL D çapraz bağlama tamponu ve daha önce saklanan 40 µL'lik girdi örneğini ekleyin, beş dakika boyunca vorteksleyin, örnekleri santrifüjleyin ve gece boyunca 65 °C'de inkübe edin.</p><p>Şimdi, ticari bir DNA saflaştırma kiti ile DNA'yı saflaştırın ve konvansiyonel lokus spesifik gerçek zamanlı kantitatif R-T-P-C-R gerçekleştirin. Bu örnekte, Arabidopsis ANA PR iki savunma geninin ekspresyonu, bitki hormonu salisilik asidin sentetik bir analoğu olan Benzo Diaz ole ile indüklenmiştir. Sonuçlar, PR iki ekspresyonunun aktivasyonunun, PR iki promotöründeki H üç ve H dört histonlarındaki lizin kalıntılarının asetilasyonundaki bir artışla ilişkili olduğunu göstermektedir.</p><p>Bu prosedürü uygularken, yaprak tozuna birinci ekstraksiyon tamponunun eklenmesinin kapalı fcon tüpünde aşırı basınca neden olduğunu unutmamak önemlidir. Lütfen tüpü ara ara açmayı hatırlayın. Ayrıca, bir sonraki tampon eklenmeden önce pelletler süspanse edilince fırçayı çıkarmamaya dikkat edin.</p><p>Bu videoyu izledikten sonra, kromatinin ve modifikasyonlarının bitki biyolojisinin farklı alanlarındaki rolüne dair temel soruları yanıtlamak için; histon modifikasyonlarının ve düz bağların nasıl belirleneceği, DNA ve histonların formaldehit tabanlı çapraz bağlanması, kromatin immünopresipitasyonunun izolasyonu ve lokusa özgü DNA kantifikasyonu hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.</p>

detection-of-histone-modifications-in-plant-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Bu protokol, kütle spektrometrisi (MS) ile histon post-translasyonel modifikasyonları karakterize etmek için tamamen entegre bir iş akışı özetlenmektedir. iş akışı nano-akış sıvı kromatografi ve veri analizi için talimatları kullanarak hücre kültürlerinde veya dokular, histon türetilmesi ve sindirim, MS analizi gelen histon arınma içerir. 3 gün - protokol 2 içinde tamamlanması için tasarlanmıştır.

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Protokol, kuraklığa dayanıklı ürünlerin mühendisliğine yardımcı olmak için potansiyel epigenetik belirteçler olarak hizmet edebilecek histone post-translational modifikasyonların profillenebilmesi için sorgum yaprağı malzemelerinden bozulmamış histonları etkili bir şekilde çıkarmak için geliştirilmiştir.

Potansiyel Epigenetik belirteçlerin Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometresi Profillemi için Sorgum Yaprak Dokusundan Histone İzolasyonu

Burada, M. oryzae ve diğer filamentli mantarların patogenezinde yeni hedef genleri tanımlayabilen histone modifikasyonlarının genom çapındaki dağılımını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.

<em>Magnaporthe oryzae'de</em> Kromatin İmmün Önkapipitasyon Dizileme Yöntemi Kullanılarak Histone Modifikasyonlarının Genom Çapında Analizi

Hedefler ve etiketleme altında bölünme (CUT&amp;Tag) etkili bir kromatin epigenomik profilleme stratejisidir. Bu protokol, tesislerdeki histon modifikasyonlarının profillenmesi için rafine bir CUT&amp;Tag stratejisi sunar.

Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme Kullanılarak Bitkilerde H3K4me3 Modifikasyonunun Profillenmesi

Bu protokol, üç boyutlu bir hücre kültürü sisteminin, kromatin modifikasyonlarını fizyolojik bir durumda modellemek, tedavi etmek ve analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini özetlemektedir.

Karaciğer Dokusunun 3D Hücre Kültürü Modelinde Histone Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Küresel Düzeyde Nicelleştirilmesi

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki <em>Etkileşimlerin in vivo</em> Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Bu protokol, aynı örnekte bitki iyon sızıntısı, peroksidaz aktivitesi ve kallos üretimini değerlendirmek için yüksek verimli bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal İkincil Metabolitlere Yaprak Yanıtlarının Yüksek Verimlilikli Bir Formatla Değerlendirilmesi

Öğrenin, bitki genlerinde histon modifikasyonlarını ChIP ve gerçek zamanlı PCR ile nasıl tespit edeceğinizi. Arabidopsis'te gen düzenlemesi ve stres yanıtlarını incelemek için güvenilir bir yöntem sunar.

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Daha fazla video keşfet