JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 2:55 dk • July 8th, 2025
Doğal öldürücü veya NK hücreleri ve kanser hücreleri içeren çok kuyulu bir plaka alın. Kontrol kuyuları sadece kanser hücrelerini içerir.
Hücresel teması kolaylaştırmak için santrifüjleyin.
Kuluçkaya yatmak. NK hücreleri üzerindeki aktive edici reseptörler, kanser hücresi yüzey ligandlarına bağlanarak NK hücrelerinin sitotoksik moleküller içeren granülleri serbest bırakmasını tetikler.
Bu moleküller kanser hücresi zarı gözenekleri oluşturur ve laktat dehidrojenaz veya LDH dahil olmak üzere hücre içi içerikleri serbest bırakarak apoptozu indükler.
Maksimum LDH salınımı için kontrol kuyularındaki kanser hücrelerini parçalamak için bir deterjan ekleyin.
LDH içeren süpernatanların bir kısmını santrifüjleyin ve bir test plakasına aktarın.
Tahlil reaktifini ekleyin ve inkübe edin.
LDH, laktatı piruvata dönüştürerek NAD + 'yı azaltır. Diaphorase, tetrazolium tuzunu azaltmak için NADH kullanır ve kırmızı renkli bir formazan ürünü oluşturur.
Enzimatik reaksiyonu durdurmak için asidik bir çözelti ekleyin.
Kuyucuklardaki formazan emilimini ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.
Formazan yoğunluğu, test kuyucuğundaki parçalanmış kanser hücrelerinin sayısı ile orantılıdır ve kanser hücrelerine karşı NK hücre sitotoksisitesini gösterir.
İlk olarak, yuvarlak tabanlı kültürle muamele edilmiş 96 oyuklu bir plaka elde edin ve metin protokolünün tablo 1'inde belirtildiği gibi ayarlayın. Efektör ve hedef hücrelerin temas halinde olduğundan emin olmak için tahlil plakasını 4 dakika boyunca 250 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, plakayı 5 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
Süpernatantların toplanmasından 45 dakika önce, hedef hücre maksimum LDH salım kuyucuklarına 10 mikrolitre 10x lizis çözeltisi ekleyin ve plakayı nemlendirilmiş odaya geri koyun. İnkübasyon tamamlandığında, plakayı 4 dakika boyunca 250 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, her kuyucuktan 50 mikrolitrelik alikotları 96 oyuklu yeni bir düz tabanlı tahlil plakasına aktarmak için çok kanallı bir pipetleyici kullanın.
Tahlil plakasının her bir oyuğuna 50 mikrolitre tahlil reaktifi ekleyin. Işıktan korumak için plakayı folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bundan sonra, her kuyucuğa 50 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin. Durdurma çözeltisini ekledikten sonraki 1 saat içinde plakayı okuduğunuzdan ve absorbansı 490 nanometrede kaydettiğinizden emin olun.