Antijene Özgü CAR T Hücrelerinin Üretilmesi için Bir Teknik

Rekombinant fibronektin fragmanları ile kaplanmış bir mikrokuyu plakası alın ve aktive edilmiş murin CD8 pozitif T hücreleri ekleyin.

Bir kimerik antijen reseptörünü veya CAR'ı kodlayan transgenik bir RNA içeren retroviral vektörleri tanıtın.

Kontaminasyonu önlemek için plakayı örtün ve bir torbaya koyun. Virüs-hücre etkileşimini kolaylaştırmak için plakayı düşük hızda santrifüjleyin.

Fibronektin, virüse ve hücreye bağlanır ve virüs aracılı gen transferini arttırmak için onları birlikte lokalize eder.

Santrifüjleme sonrası, kapalı torbayı çıkarın ve plakayı fizyolojik koşullar altında inkübe edin.

Viral vektörün zarfı hücre zarı ile birleşerek viral RNA ve enzimleri serbest bırakır.

Viral enzimler, salınan RNA'yı ters kopyalar ve elde edilen DNA'yı konakçı genomuna entegre ederek hücrelerin yüzeye bağlı CAR'ları ifade etmesini sağlar.

CAR, hedef antijene özgü bir antijen bağlama alanı ve T hücresi aktivasyonu için sinyal alanları içerir.

Antijene özgü CAR T hücreleri, aşağı akış tahlilleri için hazırdır.

1. günde, 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 0,5 mililitre Fibronektin ekleyerek ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe ederek insan fibronektin fragmanı kaplı plakaları hazırlayın.

Ertesi gün, fibronektin çözeltisini çıkarın ve kuyucuk başına PBS'ye 1 mililitre% 2 BSA ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve işlenmiş kuyucukları 1 mililitre steril PBS ile yıkayın. Yıkama solüsyonu çıkarıldıktan sonra plaka kullanıma hazırdır.

Tripan mavisi kullanarak aktive edilmiş CD8 T hücrelerini sayın. Bunları santrifüjleme ile toplayın ve transdüksiyon için mililitre başına 5 milyon canlı hücrede yeniden süspanse edin. Fibronektin kaplı plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre aktive edilmiş CD8 hücre süspansiyonu ekleyin. Daha sonra, önceden hazırlanmış virüs içeren ortamdan 1,5 ila 2 mililitre ekleyin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için dönen bir hareket kullanarak karıştırın.

Plakayı kilitli bir torbaya koyun ve 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca 2000 kez g'de santrifüjleyin. Plakayı santrifüjden çıkarın ve biyolojik güvenlik kabinine götürün. Plastik torbayı dikkatlice çıkarın ve plakanın dışının ortamla kirlenmediğinden emin olun. Plakayı 37 santigrat derece karbondioksit inkübatörüne aktarın.

4 saat sonra, her kuyucuktan 1 mililitre orta çıkarın. 1 mililitre önceden ısıtılmış tam T hücresi ortamı ile değiştirin ve plakayı inkübatöre geri koyun.