JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 2:43 dk. • July 8th, 2025
Pozitif yüklü polimerler içeren donmuş bir polimer çözeltisi ile başlayın.
Polimer çözeltisini oda sıcaklığına ulaşana kadar çözdürün.
Homojen bir çözelti elde ederek homojen bir karışım elde etmek için bir tampon ve girdap ekleyin.
Optimum reaksiyon için hedef mRNA'yı polimer çözeltisine eşit oranda ekleyin.
Pozitif yüklü polimerlerin elektrostatik etkileşimler yoluyla mRNA'daki negatif yüklü fosfat grupları ile etkileşime girmesine izin vermek için inkübe edin.
Bu, mRNA'nın polimer yapısına dahil edilmesini kolaylaştırır ve mRNA-polimer komplekslerinin veya poliplekslerin nanopartiküllerini oluşturur.
Bu polipleksleri RNaz içermeyen su içeren bir tüpe aktarın.
Bunları karıştırın ve poliplekslerin çökelmesine izin verin.
Sükroz içeren bir tampon ekleyin ve dondurun. Sükroz, poliplekslerin yapısal bütünlüğünü koruyan bir kriyoprotektan görevi görür.
Ardından, su kalıntılarını gidermek için dondurarak kurutma yapın.
İleride kullanmak üzere bir mRNA aşı adayı olarak düşük bir sıcaklıkta saklayın.
Polipleks oluşumu için, önceden hazırlanmış polimerler C-6 peptit poli-beta amino esterlerini çözün ve çözeltiyi girdaplayın. Polimer karışımını yukarı ve aşağı pipetledikten sonra, sodyum asetat içinde 12,5 milimoluk bir çözelti hazırlayın. Solüsyonu girdaplayın ve 10 dakika bekleyin.
Daha sonra, mRNA'yı mililitre başına 0,5 miligramda hazırlayın ve pipetleyerek karıştırın. Polimer çözeltisini tekrar girdaplayın. Daha sonra, polimer çözeltisindeki genetik materyal çözeltisini bir mikrosantrifüj tüpünde bire bir oranında karıştırın ve tüpü bir termal blokta 30 dakika boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneyi suyu içeren bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyerek karışımı bir ila iki RNaz içermeyen su ile çökeltin.
Daha sonra, yardımcı maddeleri dahil etmek için, mRNA ve poli-beta amino esterlerin karışımı ile aynı hacimde 20 milimolar HEPES ve yüzde 4 sükroz çözeltisi ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Liyofilizasyon için, polipleks çözeltiyi eksi 80 santigrat derecede bir saat dondurduktan sonra, birincil kurutmayı gerçekleştirin, ardından yeniden hidrasyonu önlemek için polipleksleri hemen eksi 20 santigrat derecede saklayın.