Afinite Kromatografisi Kullanılarak Kendi Kendine Birleşen Protein Nanopartiküllerinin Saflaştırılması

Polihistidin etiketli rekombinant kendi kendine birleşen protein nanopartiküllerini ifade eden mühendislik ürünü bakterilerin bir süspansiyonunu alın.

Hücre içi bileşenleri serbest bırakmak için sonikat.

Süpernatan içeren protein nanopartiküllerini toplamak için santrifüjleyin. İmidazol içermeyen bir tamponla seyreltin.

İmmobilize nikel katyonları olan agaroz boncukları içeren bir afinite kromatografi sütunu alın.

Kolon dengelemesi için düşük imidazol konsantrasyonuna sahip bir tampon ekleyin.

Bakteriyel lizatı kolona ekleyin.

Çalışma sırasında, protein nanopartikülleri üzerindeki polihistidin, nikel katyonları ile güçlü bir şekilde bağlanır.

Bu arada, bakteriyel lipopolisakkaritler ve diğer proteinler gibi kirleticiler kolona zayıf bir şekilde bağlanır.

Zayıf bağlı proteinleri çıkarmak için düşük imidazol konsantrasyonu içeren bir tampon ile yıkayın.

Lipopolisakkaritleri çıkarmak için izopropanol ekleyin ve ardından yıkayın.

Daha sonra, bir ara imidazol konsantrasyonuna sahip bir tampon yerleştirin. İmidazol, nikel katyonuna bağlanmak için histidin ile rekabet eder ve bağlı protein nanopartiküllerini serbest bırakır.

Daha sonra, protein nanopartiküllerini tamamen elüte etmek için yüksek bir imidazol konsantrasyonu içeren bir tampon ekleyin.

Daha fazla uygulama için saflaştırılmış protein nanopartiküllerini toplayın.

Altı sarmal demeti SAPN'yi ifade eden hasat edilmiş E. coli'nin parçalanması için, 150 watt'lık bir sonikasyon çıkışına sahip bir prob kullanın, dört saniye sonikasyon ve altı saniye dinlenme ile, 40 mililitre imidazol içermeyen tamponda yeniden askıya alınmış bakteri peletlerini beş dakika boyunca sonikasyon yapın.

Arıtılmış bir süpernatan oluşturmak için hücresel lizatı santrifüjleyin ve süpernatanı steril 150 mililitrelik bir şişeye aktarın. Ardından, numuneyi taze imidazol içermeyen tampon ile 100 mililitrelik son hacme getirin.

İlgilenilen proteini izole etmek için FPLC yazılımını açın ve Yeni Yöntem seçeneğini tıklayın. Yöntem Ayarları menüsünde, Sütun Konumu açılır menüsünü açın ve C1 Bağlantı Noktası 3'ü seçin. Tekniğe Göre Gösterildi açılır menüsünde Benzeşim'i seçin. Sütun Türü açılır menüsünde Diğerleri, HisTrap HP ve beş mililitre'yi seçin. Kolon hacmi ve basınç kutuları otomatik olarak uygun değerlere ayarlanacaktır.

Metot Anahattı'nı tıklatın ve Faz Kitaplığı menüsünü kapatmadan önce Denge ve Örnek Uygulama düğmelerini, üç Sütun Yıkama düğmesini ve Elüsyon düğmesini okun yanındaki Faz Kitaplığı açılır menüsünden sürükleyin. Dengeleme'ye tıklayın ve tabloda listelenen değerleri İlk Arabellek B, %4, Son Arabellek B, %4 ve Sütun Hacmi, 5 olarak ayarlayın.

Örnek Uygulama'ya tıklayın. Sample Loading ( Numune Yükleme) kutusunda, Inject Sample on Column on Column with Sample pump (Numune Pompası ile Örneğe Numune Enjeksiyonu) seçeneğinin yanındaki kutunun işaretli olduğunu onaylayın Sistem Pompa Kutusu ile. Hacim kutusu değerini 100 mililitre olarak ve Kesir Toplama Şeması'nı Etkinleştir olarak değiştirin.

Yöntem Ayarları'ndan Kesir Boyutunu Kullan kutusunun işaretini kaldırın ve kesir boyutunu dört mililitre olarak değiştirin. İlk Sütun Yıkama düğmesine tıklayın. Tabloda listelenen değerleri İlk Arabellek B, %4, Son Arabellek B, %4 ve Sütun Hacmi, 10 olarak ayarlayın. Kesir Toplama Şeması Etkinleştir kutusunu tıklatın ve Yöntem Ayarları için Kesir Boyutunu Kullan seçeneğinin işaretini kaldırın. Kesir boyutunu dört mililitre olarak değiştirin ve ikinci Sütun Yıkama düğmesine tıklayın.

Tablodaki değerleri İlk Arabellek B, %0, Son Arabellek B, %0 ve Sütun Hacmi, 5 olarak ayarlayın. Kesir Toplama Şeması Etkinleştir kutusunu tıklayın ve Yöntem Ayarları'ndan Kesir Boyutunu Kullan seçeneğinin işaretini kaldırın. Kesir boyutunu 4 mililitre olarak değiştirin ve Üçüncü Sütun Yıkama düğmesine tıklayın. Tablodaki değerleri İlk Arabellek B, %0, Son Arabellek B, %0 ve Sütun Hacmi, 10 olarak ayarlayın. Kesir Toplama Şeması Etkinleştir düğmesine tıklayın ve Yöntem Ayarları için Kesir Boyutunu Kullan kutusunun işaretini kaldırın. Ardından, kesir boyutunu 4 mililitre olarak değiştirin.

Elution düğmesine tıklayın ve tablodaki bilgilere sağ tıklayın. Açılır menüde, Adımı Sil'i tıklatın ve İzokratik Degrade düğmesini tabloya iki kez sürükleyerek iki giriş olmasını sağlayın. İlk girişin değerini İlk Arabellek B, %30, Son Arabellek B, %30 ve Sütun Hacmi, 10 olarak ayarlayın.

İkinci girişin değerini İlk Arabellek B, %100, Son Arabellek B, %100 ve sütun hacmi, 10 olarak ayarlayın. Kesir Toplama Şeması Etkinleştir düğmesini tıklatın ve Yöntem Ayarları için Kesir Boyutunu Kullan kutusunu tıklatın. Ardından, Farklı Kaydet'e tıklayın ve dosyayı Arıtma'ya göre adlandırın.

FPLC'nin pompa A hortumunu imidazol içermeyen yıkama tamponuna ve pompa B hortumunu 500 milimolar imidazol tamponuna yerleştirin. Numune pompası hortumunu 100 mililitrelik numuneye yerleştirin ve saflaştırma programını çalıştırın. %60 izopropanol yıkama gerektiğinde, programı duraklatın, pompa hortumunu imidazol içermeyen yıkamadan %60 izopropanol yıkamaya taşıyın ve programı yeniden başlatın. Yıkamanın sonunda programı tekrar duraklatın, pompa A hortumunu imidazol içermeyen yıkama tamponuna geri koyun ve arıtma programını yeniden başlatın.