$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Kemik iliği kök hücre kültürü ile başlayın.
Hücreleri ayırmak ve hücre kümelerini kırmak için tek hücreli bir süspansiyon oluşturan tripsin-EDTA tamponunu tanıtın.
Santrifüj, ardından süpernatanı çıkarın. Peleti taze bir ortamla yeniden askıya alın.
Süspansiyonu bir şırıngaya aktarın ve bir membran filtre ünitesine bağlayın.
Pistonu itin ve süzüntü içeren ortamı atın.
Filtreyi çıkarın. Şırıngayı taze bir ortamla doldurun. Filtreyi tekrar bağlayın ve pistonu hızla itin.
Sıvının basıncı, hücreyi filtre gözeneklerine doğru zorlar.
Bu, küresel bir plazma zarı vezikülü veya PMV üretir.
Bu veziküller, zarla çevrili hücre bileşenleri ve organelleri içerir.
Yarı saydam küresel vezikülleri gözlemlemek için süzüntüyü ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobu altında inceleyin.
Veziküllerin boyutları, filtre membranının gözenek boyutuyla eşleşir ve PMV'lerin oluşumunu doğrular.
PMV'leri oluşturmak için, önce, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde altı oyuklu bir plakanın bir oyuğunda tam DMEM kültür ortamında kültür faresi PMSC'leri. Hücreler% 90 birleşmeye ulaştığında, kuyuyu 0,5 mililitre kalsiyum içermeyen PBS ile durulayın ve hücreleri 0,5 mililitre% 0,25 tripsin-EDTA ile ayırın.
37 santigrat derecede üç dakika sonra, hücre ayrışmasını kolaylaştırmak ve 1 mililitre kültür ortamı ile sindirimi durdurmak için plakaya avuç içi ile birkaç kez vurun. Hücreleri santrifüjleme için 5 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve peleti 4 mililitre taze kültür ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri yeni bir altı oyuklu plakanın iki oyuğu arasında bölün ve plakayı 24 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.
Ertesi gün, az önce gösterildiği gibi, tripsin sindirimi ile hücreleri bir kuyudan hasat edin, santrifüjleme ile toplandıktan sonra peleti 0.5 mililitre taze kültür ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri 1 mililitrelik bir insülin şırıngasına yükleyin ve şırıngayı bir filtre ünitesine takın. Hücreleri filtreden sıkmak ve ekstrüde edilmiş ortamı atmak için pistona hızla basın. Ardından, az önce gösterildiği gibi, filtreden 0,5 mililitre ekstra kültür ortamı yükleyin ve dağıtın, ortamı ikinci ekstrüzyondan toplayın.
Toplanan ortamın 150 mikrolitresini 35 mililitrelik bir cam tabanlı tabağa tohumlayın ve veziküllerin yaklaşık 10 dakika oturmasına izin verin. Ardından, 20 kat objektif lens kullanan bir CCD kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobu altında PMV'lerin varlığını onaylayın.