Dönüştürülmüş Maya Hücrelerinin Fare Bağırsak Bağışıklık Sistemine Oral Verilmesi

Urasil nükleobaz üretemeyen genetik olarak dönüştürülmüş, oksotrofik maya süspansiyonu içeren bir oral tüp ile başlayın.

Oral tüpü kısıtlanmış bir farenin ağzına yerleştirin ve mideye doğru yönlendirin.

Maya süspansiyonunu doğrudan mideye uygulayın ve sonunda ince bağırsağa ulaşmasını sağlayın.

İnce bağırsak, bağışıklık hücreleri açısından zengin Peyer yamaları ile altta yatan epitel hücreleri içerir.

Peyer yamalarının yakınındaki özel bağırsak epitel hücreleri olan mikro kıvrım hücreleri, maya hücrelerini yutar ve onları veziküllere içselleştirir.

Bu veziküller hücreler boyunca hareket eder ve maya hücrelerini alttaki Peyer yamasına bırakır.

Peyer yamasını feda edilen fare bağırsağından izole edin ve düzgün bir hücre süspansiyonu elde edin.

Bu hücre süspansiyonunu urasil içeren maya seçici bir ortam üzerinde kültürleyin.

Oksotrofik maya, urasili kullanır ve koloniler oluşturmak için çoğalır, bu da dönüştürülmüş maya hücrelerinin fare bağırsağı bağışıklık sistemine verilmesini doğrular.

Maya kültürlerini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, hücre konsantrasyonunu belirlemek için bir hemositometre kullanın ve mililitre başına 10 ila dokuzuncu hücreye ayarlayın. Hücreleri üç dakika boyunca 2.500 kez g'de santrifüjleme ile peletleyin. Daha sonra, süpernatanı dökün ve uygun hacimde steril su ekleyerek ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin.

Uygun bir ölçü gavaj iğnesini 1 mililitrelik steril bir şırıngaya sabitleyin ve maya örneğini yükleyerek hava kabarcıklarını ortadan kaldırın. Kontrol farelerini tahrip etmek için steril su ile ek bir şırınga yükleyin. Baskın olmayan elinizi kullanarak, fareyi gavabed edilecek şekilde kaldırın ve işaret parmağı ve başparmak ile boynun etrafındaki cildi sıkıca kavrayın. Kuyruğu küçük parmağın altına sokun. Tutamağın sağlam olduğundan ve farenin başını hareket ettirmesini yasakladığından emin olun.

Daha sonra, iğneyi ağzın çatısı ve boğazın arkası boyunca açı vererek, merkezin hafifçe soluna tutarak gavaj iğnesini fare yemek borusuna nazikçe sokun. Farenin iğnenin ampulünü yutmasını bekleyin. Direnç hissedilirse veya fare nefes alırsa, iğneyi nazikçe çıkarın ve yemek borusunu bulmak için tekrar deneyin.

Fare, gavaged iğnenin ampulünü yuttuktan sonra, mayayı doğrudan fare midesine uygulamak için şırınga pistonuna hafifçe bastırın. Gavaj iğnesini farenin midesinden ve yemek borusundan nazikçe çıkarın ve fareyi kafese geri koyun. Gavajın düzgün bir şekilde yapıldığından emin olmak için farenin nefes alıp verdiğini ve normal şekilde hareket ettiğini kontrol edin.

Fareyi metin protokolüne göre feda ettikten sonra, karın tamamen açıkta kalacak şekilde konumlandırın ve karın bölgesine püskürtmek için %70 etanol kullanın. Makasla, kürk ve deriden enine bir kesi yapın. Ardından, karın organlarını kaplayan ince seroza astarı olan peritonu daha fazla ortaya çıkarmak için kesiği manuel olarak kaldırın. Peritonu yavaşça kaldırın ve bağırsakları ortaya çıkarmak için enine bir kesi yapın.

Ardından, ince bağırsağı mezenterik arterlerden, yağdan ve diğer dokulardan dikkatlice uzaklaştırmak için künt forseps kullanın. İnce bağırsağı, fare karnının sol üst çeyreğindeki mideden, kalın bağırsağın başlangıcındaki büyük bağırsak dokusu cebi olan çekuma maruz bırakın.

Daha sonra, ince bağırsak boyunca 1 ila 2 milimetrelik kabaca dairesel opak doku yamaları arayarak Peyer'in yamalarını izole edin. Daha sonra, kavisli diseksiyon makası kullanarak, Peyer yamasının kubbesini kesin ve çevredeki dokuların hiçbirinin toplanmamasını sağlamak için kenar boşlukları bırakın.

Disseke edilmiş Peyer'in yamalarını tam IMDM'ye aktarın. Ardından, süspanse Peyer yamaları ile çözeltiyi 40 mikrometrelik bir hücre süzgecine dökün. Peyer'in yamalarını tam IMDM ile yıkadıktan sonra, dokuyu nazikçe parçalamak ve hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte toplamak için 1 mililitrelik bir şırıngadan bir piston kullanın. Süzülmüş hücreleri yedi dakika boyunca 1.800 RPM'de peletleyin. Ardından bekleyin ve hücreleri metin protokolüne göre analiz edin.