JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 4:21 dk. • July 8th, 2025
Tümörle ilişkili nötrofiller veya TAN'lar içeren bir murin melanom tümörü alın.
TAN'lar, anjiyogenezi, tümörlerde kan damarlarının çoğalmasını uyaran ve tümör büyümesini kolaylaştıran nikotinamid fosforibosiltransferaz veya NAMPT enziminin yüksek aktivitesini gösterir.
Dokuyu kıyın ve doku matrisini bozmak için enzimler ekleyin, hücreleri gevşetin.
Süspansiyonu bir süzgeçten geçirin ve hücreleri peletlemek için santrifüjleyin.
Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için bir lizasyon tamponu ekleyin, ardından süpernatan içeren hücre kalıntılarını santrifüjleyin ve atın.
Hücresel Fc reseptörlerini bloke etmek için antikorlar ekleyin, böylece spesifik olmayan immün boyamayı önleyin.
TAN'lardaki yüzey belirteçlerine özgü florofor etiketli bir antikor kokteyli ve ölü hücreleri ayırt etmek için bir boya ekleyin.
FACS kullanarak, florofor etiketli canlı TAN'ları izole edin ve bunları bir mikroplaka üzerine aktarın.
Seçilen kuyucuklara NAMPT aktivitesini bloke eden bir inhibitör ekleyin ve inkübe edin.
Anjiyogenez uyarıcı kapasitelerini değerlendirmek için hücreleri kullanın. İnhibitör ile tedavi edilen TAN'lar, tedavi edilmeyen TAN'lara kıyasla azalmış anjiyogenez gösterir.
Tümörle ilişkili nötrofil izolasyonu için, hasat edildikleri gibi steril altı oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına kuyu başına beş tümör yerleştirin ve tümörleri 2 ila 3 milimetrelik parçalar halinde kıymak için steril makas kullanın. Daha sonra, tümör parçalarını 1 mililitre disk bazlı kollajenaz, DNaz I çözeltisi ile 37 santigrat derecede 45 dakika ve nem ile% 5 karbondioksit ile sindirin, numuneleri her 15 dakikada bir 10 mililitrelik bir şırınga ile karıştırın.
İnkübasyonun sonunda, hücreleri 100 mikrometre süzgeçlerden süzün, sindirilmemiş lifleri çıkarmak için oyuk başına 15 mililitrelik bir tüpe süzün ve 15 mililitrelik bir son hacme PBS ekleyin. Ayrışmış hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve kırmızı kan hücrelerini tüp başına 1 mililitre lizis tamponu ile parçalayın.
Karıştırdıktan sonra, her tüpten gelen içeriği tek bir 15 mililitrelik tüpte birleştirin ve iki dakika sonra 11 mililitre tam 4 santigrat derece ortam ile reaksiyonu durdurun. Santrifüjlemeden sonra, peleti 1 mililitre PBBS içinde yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 15 dakika boyunca üç mikrolitre FC bloke antikor ile spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.
İnkübasyonun sonunda, hücreleri anti-CD11b ve Ly6G antikorları ve ilgilenilen diğer antikorlar artı ışıktan korunan buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyon için DAPI ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri 14 mililitre PBS'de yıkayın ve peletleri buz üzerinde mililitre taze tam orta konsantrasyonda 1 x 107 hücrede yeniden süspanse edin.
Daha sonra, CD11b pozitif Ly6G yüksek DAPI negatif nötrofilleri standart sıralama protokollerine göre floresanla aktive edilmiş bir hücre sıralayıcıda sıralayın ve sıralamanın sonunda akış sitometresinde izole edilen nötrofillerin saflığını kontrol edin. İn vitro tümörle ilişkili nötrofil inhibisyonu için, 96 oyuklu bir U-alt plakanın iki oyuğunun her birine 1.5 kez 10 ila beşinci sıralanmış nötrofilleri tohumlayın ve FK866'yı tam ortamda 100 nanomolar nihai konsantrasyona ekleyin. Hücre kültürü inkübatöründe iki saat sonra, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve sonraki enjeksiyon için uygun konsantrasyonda PBS'deki peletleri yeniden süspanse edin.