Mycobacterium bovis BCG Üzerinde Hedef Antijenlerin Sunulması İçin Bir Avidin-Biotin Konjugasyon Tekniği

Bakteri topaklanmasını önlemek için iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ile muamele edilmiş bir Mycobacterium bovis BCG süspansiyonu ile başlayın.

Ardından, bir biyotinilasyon reaktifi ekleyin ve inkübe edin.

İşlevsel bir bağlayıcıya kompleks oluşturan bir biyotin kompleksi olan bu biyotinilasyon reaktifi, biyotin moleküllerinin bakteri yüzey proteinlerine bağlanmasını kolaylaştırarak bakterileri etiketler.

İnkübasyon sonrası, reaksiyona girmemiş biyotinilasyon reaktifini çıkarmak için biyotin etiketli bakteri süspansiyonunu santrifüjleyin.

Bakterileri bir tampon içinde yeniden süspanse edin. Monomerik avidin ile kaynaşmış bir hedef antijen alanı içeren rekombinant bir protein olan avidin-füzyon proteininin bir çözeltisini ekleyin.

İnkübasyon sırasında avidin, biotin'e bağlanarak hedef antijenlerle bakteriyel yüzey modifikasyonunu kolaylaştırır.

Bağlanmamış füzyon proteinlerini çıkarmak için süspansiyonu santrifüjleyin.

Antijen kaplı bakterileri iyonik olmayan bir yüzey aktif madde içeren bir tampon içinde yeniden süspanse edin. Bakteriler üzerindeki antijen kaplaması, bağışıklık tepkilerini tetikleme özelliğini artırabilir.

Kişisel koruyucu ekipman kullanarak bir biyogüvenlik kabininde çalışın çünkü BCG seviye II bir patojendir.

BCG hücrelerinin yüzeyini biyotinile etmek için, önce hücreleri bir çalkalayıcı platformda uygun yoğunluğa kadar büyütün. Yaklaşık 1 milyar hücre toplayın ve 500 mikrolitre buz gibi soğuk endotoksin içermeyen PBST kullanarak üç kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri döndürün ve steril endotoksin içermeyen PBS'de askıya alın. Ardından, steril filtrelenmiş suda taze 10 milimolar Sulfo-NHS SS biyotin hazırlayın. Daha sonra, bakterileri 0.5 milimolar Sulfo-NHS SS biotin içeren 1 mililitre et suyunda inkübe edin. İnkübasyonu oda sıcaklığında 30 dakika boyunca gerçekleştirin.

Daha sonra, reaksiyona girmemiş reaktifi çıkarmak için şimdi etiketlenmiş bakterileri 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBST ile üç kez yıkayın. Ardından, peleti 1 mililitre PBST'de yeniden süspanse edin.

Mililitre başına 10 mikrogram proteinin nihai konsantrasyonu için 500 milyon biyotinile BCG'yi avidin füzyon proteini ile karıştırın. Bu reaksiyonun bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat gitmesine izin verin. Daha sonra, bakterileri 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBST ile üç kez yıkayın.