İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Tek Pozitif CD8 T Hücrelerinin Üretilmesi

Kültür, bir jelatin matrisi üzerinde bir stromal hücre besleyici tabakası üzerinde pluripotent kök hücreleri indükledi.

Besleyici katman, doğal hücre dışı ortamı taklit eder ve kök hücre farklılaşmasını hematopoietik progenitör hücreler içeren kubbe şeklindeki organoidlere yönlendirir.

Birlikte kültürlenmiş hücreleri ayırmak için enzimler ekleyin.

Stromal hücre yapışması için hücreleri taze jelatin kaplı bir kaba aktarın.

Yapışmamış hematopoietik progenitör hücreleri bir farklılaşma ortamında toplayın.

CD4 ve CD8 reseptörleri olan çift pozitif T hücrelerine ve her iki reseptörden yoksun çift negatif T hücrelerine progenitör hücre farklılaşmasını teşvik etmek için bunları taze bir besleyici tabaka üzerinde kültürleyin.

Hücreleri bir tüpe aktarın. Bunları, çift pozitif T hücrelerini seçici olarak etiketleyen CD4'e özgü antikorlar taşıyan manyetik boncuklarla inkübe edin.

Çift pozitif hücreleri izole etmek için manyetik bir ayırıcı kullanın ve bunları yeni bir besleyici tabaka üzerinde kültürleyin.

Hücreleri uyarmak, CD4 reseptör aşağı regülasyonunu indüklemek ve CD8-tek pozitif hücrelere farklılaşmalarını teşvik etmek için bir sitokin ve antikor karışımı ile takviye edin.

İnsan IPSC'leri ile ortak kültürden bir hafta önce jelatinleştirilmiş OP9-delta-1 yemekleri hazırlayın. Üç yeni hücre kültürü kabına 4 mililitre% 0.1 jelatin ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra jelatini aspire edin ve her yemeğe 8 mililitre OP9 ortamı ekleyin. OP9-delta-1 hücrelerinin birleşik bir kabını üç jelatin kaplı tabağa geçirin.

Dört gün sonra, tabak başına toplam 20 mililitre medya için her bir hücre kabına 10 mililitre OP9 ortamı ekleyin. Hücreleri geçtikten yedi ila sekiz gün sonra OP9-delta-1 birleşme kapları üzerinde insan IPSC ko-kültürüne başlayın. Medyayı insan IPSC'lerinin birleşik bir kabından aspire edin ve 10 mililitre OP9 ortamı ekleyin.

Tek kullanımlık bir hücre geçirme aracı kullanarak hücre kolonilerini kesin ve ayırın ve 350 ila 600 küme kesilmiş koloniyi 10 mililitre taze OP9 ortamı ile önceden jelatinleştirilmiş bir OP9-delta-1 kabına aktarın. Kolonilerin eşit dağılımını sağlamak için kültür kabını yan yana ve önden arkaya sallayın. Ertesi gün, kullanılmış ortamı aspire edin ve 20 mililitre taze OP9 ortamı ile değiştirin.

Bir gün boyunca OP9-delta-1 üzerinde birlikte kültürlenen insan IPSC kümeleri, küçük, yuvarlak tek katmanlı koloniler olarak görünmelidir. 5. günde, 10 mililitre kullanılmış ortamı aspire edin ve 10 mililitre taze OP9 ortamı ekleyin. Koloniler, çok katmanlı bir karanlık merkez ile karakterize edilen ilkel mezoderm olarak farklılaşmaya başlayacaktır.

Bu işlemi 9. günde tekrarlayın, bu noktada çok katmanlı merkez yapıları kubbe benzeri şekillere dönüşecektir. Hematopoietik progenitör hücreleri 13. günde hasat edin, bu noktada yapılar kubbe benzeri alanlardan oluşan bir ağ ile çevrili koyu renkli bir merkezi organoidden oluşur. Ortamı aspire edin ve hücreleri bir kez 5 mililitre 1x fenol kırmızısı içermeyen Hank'in kalsiyum ve magnezyum veya HBSS içeren dengeli tuz çözeltisi ile yıkayın.

Yıkamadan sonra, mililitre kollajenaz-4 ila 10 mililitre HBSS başına 250 mikrolitre 5.000 birim ekleyin. Karışımı hücrelere ekleyin ve 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. HBSS-kollajenaz karışımını aspire edin ve hücreleri bir kez 5 mililitre PBS ile yıkayın. PBS ile yıkadıktan sonra, 5 mililitre% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ardından, 4 mililitre OP9 ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon yapmak için pipetleme yaparak hücre katmanını ilişkilendirin. Hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü 5 dakika boyunca 300 kez g ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 10 mililitre OP9 ortamında yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu yeni bir jelatinleştirilmiş 10 santimetrelik hücre kültürü kabı üzerine yerleştirin ve 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. Ardından, nazik pipetleme ile yapışmayan hücreleri toplayın. Hücre süspansiyonunu bir süzgeçten geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve daha önce tarif edildiği gibi santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 10 mililitre farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu yeni bir OP9-delta-1 birleşik tabağına yerleştirin. Hücreleri 16. günde el yazması talimatlara göre geçirin ve bundan sonra her beş ila yedi günde bir yapışık olmayan hücreleri geçirmeye devam edin. 35 günlük farklılaşmadan sonra, CD4 pozitif hücre popülasyonunu, üreticinin protokolüne göre CD4 manyetik boncuk izolasyonu ile zenginleştirin.

Daha sonra, hücreleri OP9 ortamında yeniden süspanse edin ve bir doku kültürü düz tabanlı 24 oyuklu birleşik OP9-delta-1 plakasının her bir oyuğuna 1 mililitre hücre süspansiyonu plakalayın. Her oyuğa 100 uluslararası birim insan IL-2, 5 nanogram insan IL-7, 500 nanogram anti-insan CD3 antikoru ve 2 mikrogram anti-insan CD28 antikoru ekleyerek hücreleri uyarın. Dört ila yedi gün sonra, daha fazla analiz için hücreler toplanabilir.