DNA parmak izi Mycobacterium Suşlarının

Bu prosedürün genel amacı, cüzzam hastalığına neden olan ve kültüre edilemeyen bakteri olan Mycobacterium leprae'nin klinik örneklerden doğrudan ayırt edici bir DNA parmak izini geliştirmektir. Hasta biyopsilerinden ekstraksiyonu yapılan M. leprae bakteriyel DNA'sı, değişken sayıdaki tandem tekrar (variable number tandem repeat) veya VNTR lokuslarına özgü floresan primerler kullanılarak multipleks PCR ile amplifiye edilir. DNA amplifiye edildikten sonra, fragment uzunluk analizini gerçekleştirmek için kapiler elektroforez uygulanır.

Her bir lokustaki kısa tandem tekrar DNA segmentlerinin sayısını belirlemek için veriler analiz edilir. EPRI'nin farklı suşları, her lokusta farklı sayıda tandem tekrar sergilediği için, birden fazla lokustan elde edilen veriler benzersiz DNA parmak izleri oluşturur ve bu teknik kullanılarak hastaların suş tiplerinden oluşan bir veri tabanı oluşturulabilir.

Belirli topluluklar ve küresel ölçekte hastalar arasındaki cüzzamın popülasyon yapısı, evrimi ve iletimi karakterize edilebilir ve bu durum nihayetinde cüzzamın ortadan kaldırılması için genetik araçlar ve kanıtlar sağlar. Bu yöntem, cüzzamın yayılımını izlemek, yeni enfeksiyon kümelerini ve risk altındaki bireyleri belirlemek ve kontrol programlarının etkinliğini ölçmek için kullanılabilir. Prosedürü; laboratuvarımdaki araştırmacılar Lee ve Ron Jensen ile cihaz merkezimizden Jason Rivers gösterecektir. Standart bir KaiGen DNA ekstraksiyon kiti kullanarak klinik biyopsilerden DNA ekstre edin.

DNA elde edildikten sonra, temiz bir PCR kabini içinde yeni bir çalışma alanı hazırlayın. Herhangi bir DNA kontaminasyonunu önlemek için kabini ve bir set pipeti %70 etanol ile silin; ardından kabini ve pipetleri 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın. Kabin temizlendiğinde, her bir multiplex PCR için, çift başına bir primerin floresanla işaretlendiği dört ila beş primer çiftinden oluşan multiplex PCR kurulumu gerçekleştirilebilir.

Karıştırılmalıdır. Primer karışımlarını hazırlamak için TE tamponunda hazırlanmış 10 µM primer stoklarını kullanın; tüm ileri veya üst primerlerden eşit miktarlarda bir Eppendorf tüpüne ekleyerek 2 µM final konsantrasyonuna ulaşın. Gerektiğinde, her primer için TE tamponu ekleyin.

Başka bir ependorf tüpünde tüm ters veya alt primerleri aynı şekilde karıştırın. Primer karışımları hazırlandıktan sonra, PCR MES karışımını hazırlayın. Her örnek için tüm örnekleri ve kontrolleri içeren etiketli bir plaka haritası oluşturun.

Master mix; 12 µL KaiGen multiplex PCR mix, her bir primer havuzundan iki µL ve iki µL Q solüsyonu içermelidir. Kontrolleri kapsayacak ve pipetleme kayıplarını hesaba katacak kadar master mix hazırladığınızdan emin olun. Master mix'i kısaca santrifüj edin.

Ardından, PCR plakası her bir kuyucuğuna 18 µL master mix ekleyin. DNA örneklerinin kontamine olmasını önlemek için eldivenleri değiştirin, ayrı bir biyogüvenlik kabinini silerek dezenfekte edin. Daha önce yapıldığı gibi, kabin dekontamine edildikten sonra plakayı o kabine aktarın.

Ardından, master mix içeren her bir kuyuya iki µL DNA örneği ekleyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için aerosol önleyici pipet uçları kullandığınızdan emin olun. PCR plakalarını dikkatlice kapatın ve içeriği karıştırmak için kısa süre santrifüjleyin.

Ardından reaksiyon plakasını termosiklatöre yerleştirin ve numunelerin gönderilmesi için PCR programını başlatın. FLA için formamid boyutlandırma çözeltisini ve master mix'i hazırlayın; temiz bir eppendorf tüpüne 12 µL yüksek dforamid çözeltisi ve test edilecek her numune için 0,3 µL GeneScan 500 LID boyutlandırma standardı ekleyerek dilüe edilmiş PCR ürünlerini birleştirin. Bu çözeltiden her bir kuyucuğa 12,3 µL olacak şekilde 96 kuyucuklu optik kaliteli bir reaksiyon plakasına paylaştırın.

PCR tamamlandıktan sonra, plaka santrifüj edilir. Her örneğin konumunun plaka haritasına kaydedildiğinden emin olun. Ardından, ayrı bir 96 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa 59 µL nükleaz içermeyen su alıkotlayın ve amplifiye edilen DNA'yı 1/60 oranında seyreltmek için her kuyucuğa her bir PCR reaksiyonundan bir µL ekleyin.

DNA seyreltildikten sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak seyreltilmiş her bir PCR örneğinden bir mikrolitreyi, formamid gevşetme çözeltisi içeren plakanın ilgili kuyucuğuna aktarın. Program tamamlandığında, öngörülen boyutlardaki DNA fragmanlarının çoğaltıldığını bu aşamada doğrulamak için örnekler standart agaroz jel elektroforezi ile test edilebilir. Örnekler, FLA genetik analizör kullanılarak floresan kapiler elektroforez analizi için hazırlanır; analizden önce plakaya bir septum ekleyin ve hava kabarcıklarını gidermek ve örneği kuyucuğun dibine çökertmek için kısa süreli santrifüj yapın.

IDE, zincirleri kimyasal olarak denatüre edeceği için ısı ile denatürasyon yapmaya gerek yoktur. Plakayı bir yükleme tepsisine yerleştirin. Etiketli PCR ürününü, ABBI'S genetic analyzer 31 30 xl gibi bir kapiler elektroforez sistemi kullanarak değerlendirin.

Numuneleri, ayırıcı ortam olarak POP-7 polimeri ile doldurulmuş 50 cm'lik bir kapiler kullanarak analiz edin. DNA, lazer ve detektörün floresan etiketleri ölçtüğü kapiler ucuna doğru göç eder; analiz cihazının veri toplama yazılımını açın. Numuneler çalıştırılmadan önce analiz cihazı, boyut standardı da dahil olmak üzere kullanılan tüm boyaları tespit edecek şekilde kalibre edilmelidir. Bu numuneler için kullanılan dset, ABI'nin G5'idir. Numuneler, 1,6 kV gerilimle 15 saniye boyunca elektrokinetik olarak enjekte edilir.

15 kilovolt gerilimle 1800 saniye boyunca uygulayarak fragmanları ayırın. Her bir çalışma için toplam çalışma süresi yaklaşık 45 dakikadır. Çalışma tamamlandığında, her bir örnek için veri dosyaları oluşturun.

Dosyalar, analizörün toplama yazılımı tarafından önceden belirlenmiş bir konumdaki plaka klasörüne yerleştirilir. Dosyalar FSA formatındadır. FLA verileri, Applied Biosystems web sitesinden ücretsiz olarak temin edilebilen peak scanner yazılımı kullanılarak analiz edilebilir.

Verileri analiz etmek için önce yeni proje başlat'a, ardından dosya ekle'ye tıklayın. Pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere seçilen veri dosyalarını programa yükleyin. Yüklenen dosyaları seçip analiz edin.

Sonuçlar bir FLA kromatogramı olarak çizilmiştir. Boyutlandırma standartları turuncu pikler olarak görünürken, renkli pikler örnekte analiz edilen her bir lokus için bakteriyel DNA aplikantlarını temsil eder; baz çifti boyutunu belirlemek için bir pike tıklayın. DNA polimeraz kayma zinciri sentezi nedeniyle, bazı mikrosatellit lokusları için aynı renkte bir pik ailesi tespit edilecektir.

Bu durumlarda, seçilen pik genellikle en büyük genliğe sahip olan piktir. Test edilen her alel için kaç tane tandem tekrar segmentinin mevcut olduğunu belirlemek amacıyla, her örnekteki fragman boyutlarını pozitif kontrol boyutuyla karşılaştırın ve verileri daha sonra analiz etmek üzere bir Excel hesap tablosuna kaydedin. Bu şekilde, aynı köyden üç farklı aileye mensup yedi hastadan alınan izolatların DNA parmak izleri gösterilmiş ve analiz edilen her polimorfik lokus için tandem tekrar sayısı belirtilmiştir.

Bu veriler, B ailesinin iki üyesinin aynı suş ile enfekte olduğunu, bir üyenin ise farklı bir suş ile enfekte olduğunu göstermektedir. C ailesinin üyelerinin aynı suş ile enfekte oldukları muhtemeldir. A ailesi üyeleri için de durum aynıdır. Bu videoyu izledikten sonra, kliniklere başvuran cüzzam hastaları için V-N-T-R-D-N-A parmak izleri elde etmek amacıyla multipleks PCR ve fragman uzunluk analizinin rutin olarak nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bunlar, cüzzam hastalığının kontrolü için geleneksel epidemiyolojiyi tamamlayıcı nitelikte yeni moleküler araçlardır.