Name: DNA parmak izi Mycobacterium Suşlarının (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Öğrenin, Mycobacterium leprae suşlarını izlemek için VNTR tipizasyonu ve kapiler elektroforez kullanarak DNA parmak izi analizi yöntemini. Bu teknik, klinik örneklerden Hansen hastalığı izolasyonlarını karakterize eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansman NIH / NIAID hibe RO1-AI-63457 ve arra hibesine ek RO1-AI-63457 S1 tarafından sağlanmıştır. Biz laboratuvar grubu ve işbirlikçilerinin tüm mevcut ve geçmiş üyeleri katkıları kabul etmiş sayılırsınız.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes%5BTitle%5D)+AND+%22Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li>
<li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li>
<li>Leproma Web Server. Leproma Web Server [Internet]. , Available from: http://genolist.pasteur.fr/Leproma/ (2004).</li>
<li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li>
<li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science%3A+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li>
<li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li>
<li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li>
<li>Weng, X. iaoman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China%3A+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li>
<li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County%2C+Yunnan%2C+China%3A+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li>
<li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu%2C+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li>
<li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Leprosy+Review%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li>
</ol>

Lepra hastalardan alınan deri örneklerinin toplanması cilt kliniklerinde çalışan yetenekli klinisyenler veya teknisyenler gerektirir. Bu örnekleri ele Laboratuar çalışanları, laboratuvar mont, eldiven ve koruyucu gözlük takın ve enfekte insan veya armadillo doku örnekleri ele alırken bir biyo-güvenlik kabini içinde çalışmak çok dikkat etmelidir. Dezenfeksiyon yüzeyler ve araçları da önemlidir. DNA örnekleri kirlenmesini önlemek için temiz, steril bir biyo-güvenli kabine çalışmak önemlidir. DNA ekstraksiyonu Qiagen gibi şirketlerden ekstraksiyon kitleri geliştirme sayesinde nispeten kolay hale gelmiştir. Yol dikkatle takip edilmelidir. Kullanılmadığı zaman Tüm numuneler soğuk tutulmalıdır. Örnekleri için tekrarlanan, aşırı sıcaklık değişimleri kaçının. Bu çalışmada kullanılan DNA primerleri Bu yazının sonunda literatür referansları listesinde atıf almıştır çeşitli şirketlerden sipariş edilebilir. Kontaminasyonu önlemek için primerler ile DNA özgür bir ortamda çalışması için önlemler alınmalıdır. Astarlar kuru toz olarak gelir ve TE ile karıştırılır ve bir 100μM konsantrasyona seyreltilmelidir, sonra da küçük miktarlarda (Şekil 2a) ayrılır . Astar Çalışma çözümleri 10μM konsantrasyonları daha seyreltilir. Yine, alanları / primerler kullanılır ve hazırlanan davlumbaz DNA örnekleri kullanmayın. PCR ürünleri kullanılmadığı zaman da soğuk muhafaza edilmelidir. % 3 agaroz jel hazırlanması daha iyi DNA bant ayrımı vermek, ama çalıştırmak için uzun sürer. Tamamen niteliksel amaçlar için,% 2 genellikle yeterlidir. Agaroz jel DNA boyama için kullanılan etidyum bromür çözüm son derece aktif genotoxin deri yoluyla emilir. Bu çözüm ve büyük bir özenle ve eldiven giymek için her zaman emin olmak boyanmış jeller taşıyınız. Herhangi bir DNA numune veya etidyum bromür malzemeleri dokunduktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Etidyum bromür boyama çözüm atın, kurumsal kurallarına göre yıkama ve jeller. Jeller rutin olarak gerekli değildir; FLA yöntemleri kurulduktan sonra bu adımı ortadan kaldırılabilir. Zaman ve reaktif alıcıdır. FLA için numune hazırlamada kullanılan formamid çözüm de son derece toksik ve dikkatle ele alınmalıdır. Kendi kullanımdan sonra ellerinizi yıkayınız. Kurumsal yönergeleri izleyerek atın. Tepe Tarayıcı yazılımı kullanarak FLA sonuçları okunması zor olabilir. Allel aramaları (tandem tekrarlar sayısı) bir temel set CSU (Tablo 4-7) geliştirilmiştir. (M. diğer suşları leprae çalışılmaktadır 4-7 Tablolar herşey dahil olmayabilir dikkat edilmelidir. Listelenen aralıkları dışında kopya sayıları ile allel olabilir.) Bir nevi meydan okumadır &#39;kekeme&#39; doruklarına içerir. Bu aileler, özellikle sadece böyle 10 (TA) 2-3 baz çifti tekrarlar içeren Şüpheli İşlem zirvelerinden. Bazen okumak için doğru tepe seçmek zordur (Şekil 7). Bu şekilde, 190 bp pozitif kontrol tepe ana zirve. 2 yüksekliği düşük Peaks, 4, hatta 6 baz çiftinden daha büyük veya daha küçük ana zirve &#39;kekeme doruklarına.&#39; Denir A-atık da karışıklığa neden olabilir. A-atık önceki metin ve Şekil 8&#39;de açıklanmıştır. Son olarak, PCR ürünlerinin örnekleri oldukça bol, zirveleri çift sivri görünebilir. Bu durumda, tepe formu merkezi okuyun. (Bkz: Şekil 6, Hasta 6 ) Veri yönetimi, bu tür çalışma için zorlu bir görev olabilir. Bir görev ya da işlem tarihinden, operatör, şerit / plaka haritalar, FLA siparişleri, PCR koşulları ve yemek tarifleri, jeller ve fotoğraflar tarihleri, depolama sıcaklıkları, DNA örneğinin dilüsyonları, FLA: tüm ilgili gibi tüm deneyler için bilgi kaydetmek için önemlidir. elektronik dosya depolama yerleri, vb İyi organizasyon ve veri yönetimi, gelecekte belirli bilgi parçaları için harcanan zaman saatlerce kaydedebilirsiniz. Burada açıklanan laboratuar çalışması, Colorado State Üniversitesi ve dünyadaki diğer yerlerde birkaç yıldır devam etmektedir. Toplanan verilerin her türlü vasıta ve ileride kullanmak nasıl olabilir ne büyük resim ortaya çıkmaya başlıyor. Şekiller 10A ve 10B bu DNA parmak izi farklı M. ayırt etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek ülkelerde (10A) ve hatta arasında aile (10B) leprae suşları arasında. Aile ve toplum bağlantılı durumlarda M. taşımak için gösterilmiştir. leprae benzer veya aynı VNTR zorlanma türleri. Umut iletim şebekeleri erken bir algılama sistemi, bu insanlar ecek için geliştirilmiş olabilir cüzam iletim modu (ler) böylece daha fazla fikir edinmek mümkün olabilir.t risk ve tedavi edici ilaç tedavisi, kalıcı nörolojik ve dermatolojik hasar yapılmadan önce başlayabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> DNeasy Kan ve Doku Seti </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR seti </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Astarlar </td><td> Çeşitli </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agaroz Jel </td><td> Çeşitli </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5x veya 6x Jel Yükleniyor Tampon </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Kendi * yapmak için kullanılabilir Tarifler </td></tr><tr><td> Ethidium Bromür çözümü </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> Con ile seyreltilir. </td></tr><tr><td> Hi-Di Formamide Çözüm </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene Tarama -500 Liz </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Ekipman </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> 2 Buzdolapları </td><td> 4 ° C: DNA örnekleri için 1, 1, astar ve Multiplex reaktifler </td></tr><tr><td> 1 adet mikrodalga fırın </td><td> Agaroz ve su jeller yapmak için ısıtma veya uygun bir şekilde </td></tr><tr><td> 1 otoklav </td><td> Malzemelerin sterilizasyon veya düdüklü tencere </td></tr><tr><td> PCR makinesi </td><td> PCR </td></tr><tr><td> 2 takım pipet </td><td> 0.5-10 ul, 10-100 ul, 20-200 ul, astarlar için 1000 ul 1 set, 1 set DNA </td></tr><tr><td> Denizaltı jel elektroforezi kutusu </td><td> Formlar hazırlanması jeller ve taraklar. </td></tr><tr><td> Elektroforez Güç kaynağı </td><td> Jel kutusu bağlantı kabloları ile </td></tr><tr><td> Isı blok </td><td> Eppendorf tüpleri için </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf tüpleri / şeritler için </td></tr><tr><td> Kapiler elektroforez sistemi (genetik analizör) </td><td> Veya bu analiz, bir kurumun erişim </td></tr><tr><td> Plastik </td><td> Tek kullanımlık aerosol pipet uçları, Eppendorf tüpleri, 8-iyi şeritler, 96-iyi plakaları, optik kalitesi </td></tr><tr><td> İnternet bağlantısı olan bilgisayar </td><td></td></tr></tbody></table>

dna parmak izi<emleprae> mycobacterium</emfragment lenght analizi (fla) - değişken numarası tandem repeat (vntr)> suşlarının

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Cüzam iletim çalışma etkeni bu yana, Mycobacterium leprae, laboratuvar ortamında kültüre edemez özellikle zordur . Bakteriler tek kaynakları cüzzam hastaları ve deneysel olarak enfekte armadillos ve çıplak farelerin. Böylece, modern epidemiyolojisi kullanılan yöntemlerden birçok cüzam çalışma mevcut değildir. Lepra için DSÖ 1 tarafından uygulanan kapsamlı bir küresel uyuşturucu tedavi programına rağmen, cüzzam, yaklaşık 250.000 yeni vaka, her yıl pek çok ülkede endemik olarak kalır. 2 tüm M. leprae (mikro-ve minisatellites olarak da adlandırılır) genom 3,4 eşlenen olmuştur ve birçok lokusların 2 veya daha fazla baz çiftinden segmentleri tekrarlanan olduğu tespit edilmiştir. M. 5 Klinik suşları leprae bu lokuslar birçok tandem tekrarlanan segmentlerinin sayısı (kısa tandem tekrarlar, STR) değişebilir. 5,6,7 Değişken numarası tandem repeat (VNTR) 5 analizi, cüzzam basilinin farklı suşları ayırt etmek için kullanılır olmuştur . Lokusların bazıları diğerlerine göre daha istikrarlı, diğerleri aynı hasta, bazen daha hızlı bir şekilde değiştirmek gibi görünüyor ise, tekrar sayısı daha az varyasyon gösteren görünür. Belirli VNTRs değişkenliği gerginlik yazarak 7,8,9 için uygunluğuna ilişkin sorular getirdi, ortaya çıkan veriler, istikrar içinde farklı birden fazla lokusların, analiz etmek, değerli bir epidemiyolojik araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Birden fazla lokus VNTR analizi (MLVA) 10 Çin 11,12, Malavi 8, Filipinler 10,13, 14 ve Brezilya da dahil olmak üzere birçok ülkede cüzzam evrim ve iletim incelemek için kullanılır olmuştur. MLVA birden fazla adım içerir. İlk olarak, bakteriyel DNA klinik biyopsilerin veya yarık cilt smear (SSS) konak doku DNA ile birlikte ayıklanır 10 istenilen lokusların sonra çıkarılan DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile güçlendirilir. 4-5 farklı lokusların için floresan etiketli primerler sonra istenen DNA segmentleri varlığını doğrulamak için 10 PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi tabi olabilir. Dört reaksiyon toplam 18 lokusların amplifiye olan, reaksiyon başına kullanılan ve kapiller elektroforez kullanarak floresan parçası uzunluğu analizi (FLA) için sunulmuştur. Armadillo gelen DNA pozitif bir kontrol olarak kullanılan her bir lokus için tekrar kopya sayısı ile bilinen bir bakteri geçişli. FLA kromatogramlar sonra Tepe Tarayıcı yazılımı ve parça uzunluğu VNTR kopya (alleli) sayısı dönüştürülür kullanılarak incelenmektedir. Son olarak, VNTR haplotipleri kalıpları için analiz edilir ve hastanın klinik veriler ile bir araya geldiğinde gerginlik türlerinin dağılımını izlemek için kullanılabilir.

Neden Lepra<emLeprae&gt; Mycobacterium</em&gt;, Birçok yerde hala endemiktir. Yayılması ve cüzam iletim modu hakkında bilgi edinmek için, bunu belirlemek için önemlidir suşu<em&gt; M. leprae</em&gt; Bir hasta enfekte. Değişken sayıda tandem tekrarlar (VNTR) yazarak, böyle bir yöntem.

DNA parmak izi<emLeprae> Mycobacterium</emFragment Lenght Analizi (FLA) - Değişken Numarası Tandem Repeat (VNTR)> Suşlarının

Etken ajan olan Mycobacterium leprae'nin laboratuvar ortamında kültüre edilememesi nedeniyle, cüzzamın bulaşma yolları üzerine yapılan çalışmalar özellikle güçtür. ...

Bu prosedürün genel amacı, cüzzam hastalığına neden olan ve kültüre edilemeyen bakteri olan Mycobacterium leprae'nin klinik örneklerden doğrudan ayırt edici bir DNA parmak izini geliştirmektir. Hasta biyopsilerinden ekstraksiyonu yapılan M. leprae bakteriyel DNA'sı, değişken sayıdaki tandem tekrar (variable number tandem repeat) veya VNTR lokuslarına özgü floresan primerler kullanılarak multipleks PCR ile amplifiye edilir. DNA amplifiye edildikten sonra, fragment uzunluk analizini gerçekleştirmek için kapiler elektroforez uygulanır.Her bir lokustaki kısa tandem tekrar DNA segmentlerinin sayısını belirlemek için veriler analiz edilir. EPRI'nin farklı suşları, her lokusta farklı sayıda tandem tekrar sergilediği için, birden fazla lokustan elde edilen veriler benzersiz DNA parmak izleri oluşturur ve bu teknik kullanılarak hastaların suş tiplerinden oluşan bir veri tabanı oluşturulabilir.Belirli topluluklar ve küresel ölçekte hastalar arasındaki cüzzamın popülasyon yapısı, evrimi ve iletimi karakterize edilebilir ve bu durum nihayetinde cüzzamın ortadan kaldırılması için genetik araçlar ve kanıtlar sağlar. Bu yöntem, cüzzamın yayılımını izlemek, yeni enfeksiyon kümelerini ve risk altındaki bireyleri belirlemek ve kontrol programlarının etkinliğini ölçmek için kullanılabilir. Prosedürü; laboratuvarımdaki araştırmacılar Lee ve Ron Jensen ile cihaz merkezimizden Jason Rivers gösterecektir. Standart bir KaiGen DNA ekstraksiyon kiti kullanarak klinik biyopsilerden DNA ekstre edin.DNA elde edildikten sonra, temiz bir PCR kabini içinde yeni bir çalışma alanı hazırlayın. Herhangi bir DNA kontaminasyonunu önlemek için kabini ve bir set pipeti %70 etanol ile silin; ardından kabini ve pipetleri 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın. Kabin temizlendiğinde, her bir multiplex PCR için, çift başına bir primerin floresanla işaretlendiği dört ila beş primer çiftinden oluşan multiplex PCR kurulumu gerçekleştirilebilir.Karıştırılmalıdır. Primer karışımlarını hazırlamak için TE tamponunda hazırlanmış 10 µM primer stoklarını kullanın; tüm ileri veya üst primerlerden eşit miktarlarda bir Eppendorf tüpüne ekleyerek 2 µM final konsantrasyonuna ulaşın. Gerektiğinde, her primer için TE tamponu ekleyin.Başka bir ependorf tüpünde tüm ters veya alt primerleri aynı şekilde karıştırın. Primer karışımları hazırlandıktan sonra, PCR MES karışımını hazırlayın. Her örnek için tüm örnekleri ve kontrolleri içeren etiketli bir plaka haritası oluşturun.Master mix; 12 µL KaiGen multiplex PCR mix, her bir primer havuzundan iki µL ve iki µL Q solüsyonu içermelidir. Kontrolleri kapsayacak ve pipetleme kayıplarını hesaba katacak kadar master mix hazırladığınızdan emin olun. Master mix'i kısaca santrifüj edin.Ardından, PCR plakası her bir kuyucuğuna 18 µL master mix ekleyin. DNA örneklerinin kontamine olmasını önlemek için eldivenleri değiştirin, ayrı bir biyogüvenlik kabinini silerek dezenfekte edin. Daha önce yapıldığı gibi, kabin dekontamine edildikten sonra plakayı o kabine aktarın.Ardından, master mix içeren her bir kuyuya iki µL DNA örneği ekleyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için aerosol önleyici pipet uçları kullandığınızdan emin olun. PCR plakalarını dikkatlice kapatın ve içeriği karıştırmak için kısa süre santrifüjleyin.Ardından reaksiyon plakasını termosiklatöre yerleştirin ve numunelerin gönderilmesi için PCR programını başlatın. FLA için formamid boyutlandırma çözeltisini ve master mix'i hazırlayın; temiz bir eppendorf tüpüne 12 µL yüksek dforamid çözeltisi ve test edilecek her numune için 0,3 µL GeneScan 500 LID boyutlandırma standardı ekleyerek dilüe edilmiş PCR ürünlerini birleştirin. Bu çözeltiden her bir kuyucuğa 12,3 µL olacak şekilde 96 kuyucuklu optik kaliteli bir reaksiyon plakasına paylaştırın.PCR tamamlandıktan sonra, plaka santrifüj edilir. Her örneğin konumunun plaka haritasına kaydedildiğinden emin olun. Ardından, ayrı bir 96 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa 59 µL nükleaz içermeyen su alıkotlayın ve amplifiye edilen DNA'yı 1/60 oranında seyreltmek için her kuyucuğa her bir PCR reaksiyonundan bir µL ekleyin.DNA seyreltildikten sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak seyreltilmiş her bir PCR örneğinden bir mikrolitreyi, formamid gevşetme çözeltisi içeren plakanın ilgili kuyucuğuna aktarın. Program tamamlandığında, öngörülen boyutlardaki DNA fragmanlarının çoğaltıldığını bu aşamada doğrulamak için örnekler standart agaroz jel elektroforezi ile test edilebilir. Örnekler, FLA genetik analizör kullanılarak floresan kapiler elektroforez analizi için hazırlanır; analizden önce plakaya bir septum ekleyin ve hava kabarcıklarını gidermek ve örneği kuyucuğun dibine çökertmek için kısa süreli santrifüj yapın.IDE, zincirleri kimyasal olarak denatüre edeceği için ısı ile denatürasyon yapmaya gerek yoktur. Plakayı bir yükleme tepsisine yerleştirin. Etiketli PCR ürününü, ABBI'S genetic analyzer 31 30 xl gibi bir kapiler elektroforez sistemi kullanarak değerlendirin.Numuneleri, ayırıcı ortam olarak POP-7 polimeri ile doldurulmuş 50 cm'lik bir kapiler kullanarak analiz edin. DNA, lazer ve detektörün floresan etiketleri ölçtüğü kapiler ucuna doğru göç eder; analiz cihazının veri toplama yazılımını açın. Numuneler çalıştırılmadan önce analiz cihazı, boyut standardı da dahil olmak üzere kullanılan tüm boyaları tespit edecek şekilde kalibre edilmelidir. Bu numuneler için kullanılan dset, ABI'nin G5'idir. Numuneler, 1,6 kV gerilimle 15 saniye boyunca elektrokinetik olarak enjekte edilir.15 kilovolt gerilimle 1800 saniye boyunca uygulayarak fragmanları ayırın. Her bir çalışma için toplam çalışma süresi yaklaşık 45 dakikadır. Çalışma tamamlandığında, her bir örnek için veri dosyaları oluşturun.Dosyalar, analizörün toplama yazılımı tarafından önceden belirlenmiş bir konumdaki plaka klasörüne yerleştirilir. Dosyalar FSA formatındadır. FLA verileri, Applied Biosystems web sitesinden ücretsiz olarak temin edilebilen peak scanner yazılımı kullanılarak analiz edilebilir.Verileri analiz etmek için önce yeni proje başlat'a, ardından dosya ekle'ye tıklayın. Pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere seçilen veri dosyalarını programa yükleyin. Yüklenen dosyaları seçip analiz edin.Sonuçlar bir FLA kromatogramı olarak çizilmiştir. Boyutlandırma standartları turuncu pikler olarak görünürken, renkli pikler örnekte analiz edilen her bir lokus için bakteriyel DNA aplikantlarını temsil eder; baz çifti boyutunu belirlemek için bir pike tıklayın. DNA polimeraz kayma zinciri sentezi nedeniyle, bazı mikrosatellit lokusları için aynı renkte bir pik ailesi tespit edilecektir.Bu durumlarda, seçilen pik genellikle en büyük genliğe sahip olan piktir. Test edilen her alel için kaç tane tandem tekrar segmentinin mevcut olduğunu belirlemek amacıyla, her örnekteki fragman boyutlarını pozitif kontrol boyutuyla karşılaştırın ve verileri daha sonra analiz etmek üzere bir Excel hesap tablosuna kaydedin. Bu şekilde, aynı köyden üç farklı aileye mensup yedi hastadan alınan izolatların DNA parmak izleri gösterilmiş ve analiz edilen her polimorfik lokus için tandem tekrar sayısı belirtilmiştir.Bu veriler, B ailesinin iki üyesinin aynı suş ile enfekte olduğunu, bir üyenin ise farklı bir suş ile enfekte olduğunu göstermektedir. C ailesinin üyelerinin aynı suş ile enfekte oldukları muhtemeldir. A ailesi üyeleri için de durum aynıdır. Bu videoyu izledikten sonra, kliniklere başvuran cüzzam hastaları için V-N-T-R-D-N-A parmak izleri elde etmek amacıyla multipleks PCR ve fragman uzunluk analizinin rutin olarak nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bunlar, cüzzam hastalığının kontrolü için geleneksel epidemiyolojiyi tamamlayıcı nitelikte yeni moleküler araçlardır.

dna-fingerprinting-mycobacterium-leprae-strains-using-variable-number

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz Amerikan pika gösterildiği gibi, verimli bir şekilde zor küçük memeliler saç örnekleri toplamak için bir non-invaziv örnekleme yaklaşımı sunuyoruz. Biz örneklenmiş saç DNA açılan ve yaban hayatı ekolojisi ve korunması çalışmalarında yaygın olarak kullanılan moleküler belirteçler çeşitli yükseltme bu yöntemin yararını göstermektedir.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Kaynak: Gulla, S. ve diğerleri. Çoklu lokus değişken sayı Tandem tekrarı Balık patojenik bakteri Yersinia ruckeri'nin Multiplex PCR ve Kapiller Elektroforez ile analizi. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, balık-patojenik bakteriden türetilen floresan etiketli değişken sayı tandem tekrarı (VNTR) amplikonlarının ayrılma prosedürünü göstermekte, bakteriyel tanımlama için boyuta özgü elektroferogram profilleri oluşturmak amacıyla kapiller elektroforez kullanılarak sunulmaktadır.

Değişken Sayıda Tandem Tekrarı (VNTR) Analiziyle Balık Patojenlerinin Tespiti

Bir amplifikasyon mikrodizi önemli ölçüde son kullanıcı için mikro-dizi iş akışını tek bir oda içine asimetrik PCR amplifikasyonu ve mikrodizi hibridizasyon birleştirir. Mikrodizi iş akışı basitleştirilmesi rutin alt-kaynak ortamlarda kullanılabilir mikroarray tabanlı tanı oluşturmak için gerekli bir ilk adımdır.

Çok ilaca dirençli Demonstrating<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplifikasyon Microarray

Tekrarlayan dizileri gözlemlemek ve ölçmek için Caenorhabditis elegans'ın gonadında ve embriyolarında kısa bir floresan in situ hibridizasyon (FISH) prosedürü rapor ediyoruz. Telomer tekrarları ve telomerlerin alternatif uzama şablonu (TALT) olmak üzere iki farklı tekrarlayan diziyi başarıyla gözlemledik ve ölçtük.

Gözlem ve telomer Niceleme ve Tekrarlayan Diziler kullanma Floresan<em&gt; In Situ</emPNA Sondalar&gt; ile hibridizasyon (FISH)<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi ile pufferfish türleri genotipleme için geliştirilmiş bir polimeraz zincir reaksiyonu restriksiyon parça uzunluk polimorfizm yöntemi tarif edilmektedir. Ters-faz silis yekpare kolonu sindirilmiş amplıkonları ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, baz bileşimi tanımlamak için yararlıdır oligonükleotidlerin Monoizotopik kitleleri aydınlatmak olabilir.

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

Bu makalede, telomer uzunluğunun hızlı ve etkin bir şekilde doğrudan ölçülmesini sağlayan, modifiye edilmiş bir terminal kısıtlama fragmanı analizi kullanarak telomer uzunluğunun nicelleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol tartışılmıştır. Bu teknik telomer uzunluğunu ölçmek için çeşitli DNA hücreleri kaynaklarına uygulanabilir.

Jel Hibridizasyonunu Kullanarak Telomer Uzunluğunu Nicellemek İçin Modifiye Terminal Restriction Fragment Analysis

Multi-Locus değişken-sayı tandem-Repeat analiz (MLVA) tahlil burada sunulan ucuz, sağlam ve taşınabilir yüksek çözünürlüklü balık-patojen bakteri Yersinia ruckeriGenotipleme sağlar. Saf kültürlerden başlayarak, tahlil düşük uygulamalar için on-loci MLVA profilleri üretmek için Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez istihdam.

Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez tarafından çok-Locus değişken-sayı tandem-balık tekrar Analizi-patojen Bakterium Yersinia ruckeri

Burada VNTR locus D1S80'i epitel hücre DNA'sından yükselterek DNA parmak izi profilleri oluşturmak için basit bir protokol açıklıyoruz.

Laboratuvar Sınıflarında D1S80 Locus Kullanılarak DNA Parmak İzi Uygulaması

Bu protokol, mayaların ve küf Aspergillus fumigatus'un 7 gün gibi kısa bir sürede büyük toprak numunelerinden kültürlenmesi için etkili ve hızlı bir yöntemdir. Yöntemler, deneyler için gerektiğinde bir dizi inkübasyon ortamına ve sıcaklığına uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir.

Mantar Popülasyon Yapısını Araştırmak için Kültürlenebilir Maya ve Küflerin Topraklardan İzolasyonu

Bu çalışmada, su örneklerinde üç ana daldan Leptospira'yı tespit etmek için bir nokta-leke uygulaması tasarlanmıştır. Bu yöntem, bir anti-digoksigenin antikoru tarafından kolayca tespit edilen, digoksigenin etiketli bir prob tarafından spesifik olarak hedeflenen minimum DNA miktarlarının tanımlanmasına izin verir. Bu yaklaşım, tarama amaçları için değerli ve tatmin edici bir araçtır.

Su Örneklerinde Leptospira Tespiti için Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve Nokta-Blot Hibridizasyonu,

Öğrenin, Mycobacterium leprae suşlarını izlemek için VNTR tipizasyonu ve kapiler elektroforez kullanarak DNA parmak izi analizi yöntemini. Bu teknik, klinik örneklerden Hansen hastalığı izolasyonlarını karakterize eder.

DNA parmak izi Mycobacterium Suşlarının

Daha fazla video keşfet