Microfabricated Post-Dizi-Dedektörleri (mPADs): Mekanik Kuvvetleri yalıtın bir Yaklaşım

Merhaba, ben Nathan Snia Decky ve bugün yanımda Wes Ligan, Robbie Desai ve Mike Yang var. Ve biz Chris Chen'in burada, Pennsylvania Üniversitesi'ndeki laboratuvarındanız. Bu videoda, mikro fabrikasyon bir dizi direk kullanarak hücresel çekim kuvvetlerini ölçme yaklaşımımızı sunacağız.

Çekiş kuvvetleri, miyozin ve akton etkileşimleri yoluyla üretilir ve fizyolojimizde önemli bir rol oynar. Gelişim sırasında, dokumuzun erken yapılarını oluşturmak için hücrelerin bir yerden diğerine hareket etmesini sağlarlar. Ayrıca iyileşme sürecine de yardımcı olurlar çünkü yaraların kapanması veya lökositlerin vücudumuzdan göçü ve sürünmesi için gereklidirler.

Ancak ne yazık ki, bu aynı kuvvetler kanser metastazı veya bir tümöre doğru vasküler büyüme durumunda sağlığımıza zararlı olabilir. Dolayısıyla, bu çekiş kuvvetlerini nicel bir şekilde ve özellikle tek tek hücrelerin mikro ve nano ölçeğinde ölçebilecek çok az yöntem vardır. Hücreleri in vitro olarak incelemek için yaygın yöntemlerin çoğu cam tabanlı tabaklar veya polistiren tabaklar olmuştur, ancak bunlar çok sert substratlardır ve değildirler, bir hücrenin neden olduğu çekiş kuvvetlerini ve hakaretleri fiziksel olarak ölçmemize izin vermezler.

Ve bu nedenle, bir tür fiziksel okuma olmadan çekiş kuvvetlerinin altında yatan mekanizmaları anlamak çok zor oldu. Chris Chen'in laboratuvarında, bu sınırlamaların üstesinden gelmemizi sağlayan bir tekniğimiz var. Yöntemimiz, sertliği ve boyut ölçeği, tek tek hücrelerin birden fazla konsol üzerine yayılacağı ve işlem sırasında onları saptıracağı şekilde olan dikey bir esnek konsol dizisine dayanmaktadır.

En sık kullandığımız boyutlar üç mikron çapında, çapı silindirik direkler, 10 mikron boyunda, dokuz mikron merkezden merkeze aralık ve dikdörtgen bir dizidir. Bununla birlikte, bu boyutlar çeşitli hücresel çalışmaları barındıracak şekilde değiştirilebilir. Burada görebileceğiniz sert bir silikon master ile başlıyoruz ve ardından bunları burada gördüğümüz esnek PDMS konsollarına çeviriyoruz.

Bu tekniği kullanarak, tek tek konsolların sapmalarını mikroskop altında ölçebilir ve bu tür sapmaları oluşturmak için gereken büyüklük ve yönde hücresel çekiş kuvvetlerini geri alabiliriz. Bu alt tabakaları mikro post array dedektörler için M pedlerine dönüştürdük ve bu videoda size M pedlerini nasıl üreteceğinizi, silikon master'dan PDMS replikasyonuna ve son olarak modülasyon ve hücresel kasılmanın hesaplanmasına kadar göstereceğiz. Merhaba, burada laboratuvarlarımızın temiz odasındayız.

Bu, SU'yu silikon ustası olarak hizmet edecek sekiz direk yapmamıza izin veren tozsuz ve ışığa duyarlı bir odadır. Önce bir silikon gofret ile başlayacağız ve bununla onu SU sekiz foto direnç ile kaplayacağız, SU sekiz negatif bir direnç ve ışığa duyarlı. Dolayısıyla, bu fotoğraf maskesinden ışık tuttuğumuzda, ışığın mikro direkleri desenlemesine ve daha sonra üç boyutlu bir yapı oluşturmasına neden olacak, bu daha sonra PDMS'de döktüğümüz SU sekiz direği olacaktır.

Tüm işlemlerimizi yaptıktan sonra, gofret bu şekilde görünecek, bu da mikro direğe sahip olduğumuz yer, zaten gofret içine üretilmiş mikro direk yapıları. Bu yüzden ustaları yapmak için, önce çıplak silikon bir gofret ile başlıyoruz ve bu yedi dakika boyunca ozon tedavisi ile temizlendi ve ayrıca bu gofreti 120 santigrat derecede 30 dakika boyunca kuruttuk. Direkler için çok ince bir taban katmanı oluşturmak için SU sekiz 2002'yi bunun üzerine döndüreceğiz.

Bu yüzden SU sekizini döndüreceğimiz için, bir gaz maskesi takacağım, gofreti buradaki tutucuya yeniden yükleyin, orada olabilecek tozların tozunu alın, döndürücünün üzerine yerleştirin, ortalandığından emin olmak için kontrol edeceğiz Ve sonra bunun üzerine SU sekiz 2002'yi dökmeye devam edeceğiz. Ve sonra devam edeceğiz ve gofreti döndüreceğiz. Daha sonra bunları yumuşak fırın olan sıcak tabağa yerleştiriyoruz.

Bunu daha sonra bir dakika boyunca yapıyoruz. Daha sonra alıp 95 derecelik sıcak plakaya aktarıyoruz. Ve bunu iki dakika boyunca yapıyoruz.

Ve bittiğinde, bunu şimdi alacağız ve maske hizalayıcıda sel pozlamasını yapmak için yola çıkacağız. Tamam, bu gofret üzerinde SU sekizinin ilk katmanı olan SU sekiz'i döndürdük ve şimdi mikro direkler için ilk temel katmanı oluşturmak için tüm gofreti açığa çıkarmamız gerekiyor. Bu yüzden bu 70 milijul pozlamayı vermemiz gerekiyor.

Bu yüzden burada maske hizalayıcımızdaki ışığın gerçek yoğunluğunu ölçmemiz gerekiyor. Bu yüzden metreyi ağırlığın içine maske hizalayıcıya yüklüyoruz. Daha sonra onu ışıkla pozlandırıyoruz.

Bu UV ışığı. Silikon gofreti maske hizalayıcıya yüklüyoruz, maske hizalayıcıya yerleştiriyoruz. Ve bu sefer maskemiz yok, bu şekilde tüm filmi ortaya çıkarabiliriz.

Deklanşörü takalım ve devam edelim ve bir dakikalık pozlamayı çevirelim ve devam edip pozlama yapacağız. Yani bir dakika sonra sistem bitti, daha sonra gofreti çıkarabiliriz. Ve şimdi pozlama sonrası pişirmeyi yapmamız gerekiyor.

Bu gofreti daha yeni açığa çıkardık ve şimdi bu ilk SU sekiz kaplaması için çapraz bağlanma reaksiyonunu oluşturmak için ısı ekleyeceğiz. Bu yüzden bir dakika boyunca 65 derecelik bir sıcak plakaya yerleştiriyoruz ve ardından iki dakika boyunca 95 derecelik bir sıcak plakaya aktarıyoruz. İki dakikalık işlemden sonra, sıcak plakayı kapatıyoruz ve gofretin oda sıcaklığına soğumasına izin veriyoruz, bu da yaklaşık 30 dakika sürüyor.

Bu yüzden ikinci SU sekiz katmanımızı bu gofretin üzerine döndürdük. Ve şimdi bunu fotoğraf maskesi aracılığıyla gerçekten ortaya çıkarmamız gerekiyor. Bu sefer derin UV ışığını engellemek için bir UV filtresi kullanacağız.

Bu, alabileceğiniz bir Hoya optik cam, ancak bu sefer yoğunluğu tekrar ölçmemiz gerekiyor. Bu yüzden ışık ölçerimizi kullanacağız veya filtrelenmiş yoğunluğu ölçmek için üstteki filtreyi kullanacağız. Ve sonra maskeyi maske hizalayıcıya yükleyeceğiz.

Bu anahtar, maskeyi yerinde tutan vakum oluşturur. Daha sonra maske hizalayıcıya yerleştireceğiz. Daha sonra filtreyi üstüne yerleştireceğiz ve ardından gofretimizi içine yerleştireceğiz.

İyi bir temas olduğundan emin olmak istiyoruz, bu yüzden onu temas edecek şekilde kaldırıyoruz ve ardından pozlamaya başlayacağız Maruz kaldıktan sonra, gofretimizi maske hizalayıcısından çıkaracağız. Yani şimdi seçici olarak maruz kalan alanlarımız var. Bunu fırına, maruz kalma sonrası pişirme işlemini yapmak için sıcak Plakalara götüreceğiz.

Az önce po'yu yaptık, pozlama sonrası son pişirme işlemini, ve şimdi bu gofreti geliştireceğiz, böylece üç boyutlu yapıları elde edebiliriz. Yapacağımız şey bunu yıkamak, bunu P-G-M-E-A'da geliştirmek, bu da maruz kalmamış SU sekizini yıkayacak. Bu yüzden önce bir tabak P-G-M-E-A ile başlıyoruz ve gofreti hafif bir çalkalama ile iki dakika burada oturtuyoruz.

Bu yüzden bunu iki dakikalığına bırakacağım. Bu yüzden ikinci bir P-G-M-E-A yemeğine geçeceğiz. Bu, SU sekiz ile doymuş PGME-A'yı ortadan kaldıracaktır.

10 saniye sonra IPA'ya getireceğiz. Bu, P-G-M-E-A'yı yıkar. Onu 20 saniye boyunca buraya koyduk, yine hafif bir ajitasyonla.

Ve şu anda bağımsız posta yapılarımız var. Bu yüzden bunu düşük yüzey gerilimine sahip olan hekzanın içine koyacağız. Bir hekzanda beş saniye boyunca yıkayacağız ve sonra iki hekzanda yıkayacağız ve sonra fön çekmeye hazırız.

Bu yüzden gofreti yeni geliştirdik ve şimdi onu sıcak bir tabağa koyacağız ve sıcaklığı yavaş yavaş 50'ye çıkaracağız. Ve olan şu ki, bu yüksek sıcaklık SU sekizini daha da çapraz bağlayarak yapısal olarak daha sert hale getiriyor ve gece boyunca bu sıcak plakanın üzerinde bırakıyoruz. Bu nedenle, 14 ila 20 saat arasında herhangi bir yerde ve daha sonra sıcak plakayı kapatacağız ve tekrar oda sıcaklığına soğumasına izin vereceğiz.

Yapmamız gereken şey, bu gofreti daha küçük bir boyuta indirgemek. Temelde bu silikon gofreti kesmek ve burada sadece bu iç desenden küçük bir çip oluşturmak istiyoruz. Ve epoksi kullanacakları bu yapıya benzer bir şey olacak.

Ve bu çipi bu şekilde bir cam slayta yapıştıracağız. Bu da yapısal bir destek sağlar. Yani bir gofreti zar atmak, bu bir tür sanattır, ama yapabileceğiniz şey, temelde bir elmas yazıcı kullanmak ve sadece bir kenardan başlamak.

Ve kristal düzlemler yüzünden, sadece küçük bir çentik koydunuz Şimdi bu bir kırık oluşturdu, daha sonra bu aletle dokunabileceğim, Bunu soyabiliriz ve daha sonra burada daha fazla kesim yapabiliriz, ta ki bunun gibi küçük bir yapı elde edene kadar. Ve sonra silikon çipi şimdi hızlı bir şekilde camın üzerine yerleştirip yerine monte ediyorsunuz. Ve bunun ayarlanmasına izin verdin.

Ve işiniz bittikten sonra, buna benzer bir cihaza sahip olacaksınız. Bu yüzden silikon master'ı bu cam kızağın üzerine monte ettik ve şimdi ona bir floy kaplaması vereceğiz, bu da bu yapının daha sonra PDMS'den serbest bırakılmasına yardımcı olacak. Bu yüzden çipi bu kurutucunun içine yerleştireceğiz ve sonra bu tri Chloro Siling'den birkaç damla alacağız, kurumaya birkaç damla yerleştireceğiz.

Bunu kaputun içinde yapıyoruz çünkü bu, oldukça sert olan hidroklorik gazın bir yan ürününe sahip. Devam edin ve kapağı kapatın, bunu vakuma takın ve sonra devam edelim ve bunun vakumdan oturmasına izin veriyoruz ve tüm silikon gofret üzerinde güzel bir kaplama elde etmek için bu birikintinin gece boyunca birikmesine izin veriyoruz. Merhaba, ben Wesley Ligan.

Christopher Chen'in laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim. Bu noktada, Nate size ED alt tabakalarımız için bir silikon ustasının nasıl oluşturulacağını gösterdi. Bununla birlikte, hücresel kasılmayı ölçmek için bu aracı kullanmadan önce, ilk önce elastomerik bir silikon polimer kullanarak sert foto yapıları çoğaltmak gerekir.

İlk görevimiz, daha önce ürettiğimiz silikon ustasının negatif bir şablonunu oluşturmaktır. Bunu, PDMS polimerimize PDMS veya Polimetil Sloane adı verilen bir silikon elastomer kullanarak yapıyoruz. Şimdi bire 10 oranında bir kürleme maddesi ekliyoruz.

Çözeltiyi tarttıktan sonra, PDMS polimerini ve çapraz sızıntı maddesini iyice karıştırmak gerekir. Bu karışım açıkça çözeltimize çok fazla hava kabarcığı getiriyor. Yani bu noktada, üzerini örtmek ve vakumlu kurutucuda gazını almak gerekir.

PDMS tamamen gazdan arındırıldıktan ve tüm kabarcıklar yüzeye çıkıp patladıktan sonra, onu vakumlu kurutucudan çıkarabiliriz. Artık bu PDMS ve çapraz bağlama maddesi karışımını, silikon ustamızın negatif bir kalıbını oluşturmak için kullanabiliriz. Ve bunu yapmak için bir pasta kalıbı kullanıyoruz ve monte edilmiş silikon ustamızı bunun ortasına yerleştiriyoruz.

Daha sonra, DGA'nın polimer çözeltisini, herhangi bir ek kabarcık oluşmasını önlemeye çalışarak silikon gofretin üstündeki tabağa dikkatlice döküyoruz. Tipik olarak polimeri yaklaşık çeyrek inç kalınlığında dökmeye çalışırız. Bu işlemin kaçınılmaz olarak karışıma birkaç hava kabarcığı soktuğunu görebilirsiniz.

Şimdi bu tabağı baloncukların yüzeye çıkmasına ve patlamasına izin vermek için yaklaşık 30 dakika bir kenara koyuyoruz. Oturmasına izin verdikten sonra, PDMS'nin yüzeyinde hala birkaç hava kabarcığı olduğunu görebiliriz. Bununla birlikte, bunlar üst yüzeyde olduğu için, artık kalan kabarcıkları patlatmak için hızlı bir nitrojen patlaması kullanabiliriz.

PDMS ve CROSSLINKER çözümünü tam olarak çapraz bağlamak ve silikon ustamızın sert bir negatif şablonunu oluşturmak için 110 santigrat derecede 20 dakika pişiriyoruz. Silikon alt tabakanın üzerinde ince bir PDMS tabakası olduğunu görebiliriz. Ve ikisini birbirinden ayırmadan önce, bu tabakayı kesmek gerekiyor.

Daha sonra bu üst tabakayı aşılayabilir ve silikon substrattan nazikçe soyabiliriz. Bu noktada, negatif silikon alt tabakayı, negatif PDMS alt tabakasını silikon master'dan ters çevirebilir ve çok yavaş bir şekilde soyabiliriz. Tamam, bunu bir ucunu aşağıda tutarak ve PDMS alt tabakasını nazikçe soyarak yapıyoruz.

Alt tabaka silikon master'dan sıyrılırken ön ilerlemeyi görebilirsiniz. Artık silikon ustamızın A-P-D-M-S negatif kalıbını oluşturduğumuza göre, son ped alt tabakalarını yapmak için bunu dört ayrı negatif kalıba kesebiliriz. Bu noktada, yüzeye zarar vermemek için negatif alt tabakanın üst kısmına forseps veya eldivenlerinizle dokunmamak önemlidir.

Bu noktada, silikon master'dan üç mikron çapında, dokuz mikron derinliğinde kuyulardan oluşan dört ayrı negatif şablon oluşturduk. Yükseltilmiş konsol yüzeylerini yeniden oluşturmak için, PDMS kullanan bir PDI PDMS'den bu negatif kalıplar üzerine tekrar döküm yapabiliriz. Bununla birlikte, bunu yapmadan önce, bu negatif kalıpları bir floros ile kaplayarak yapışkan olmayan hale getirmek gerekir.

Bunu yüz watt'lık bir plazma odasında bir dakika boyunca tam güçte yapıyoruz. Haznenin plazma üzerinde geri dönüşü pompalamasına izin verdikten sonra, bu, PDMS'nin üst yüzeyini aşındıran ve onu floro Cy Lane moleküllerine daha yapışkan hale getiren bir iyon gazı alanı oluşturur. Negatif Kalıpları vakumlu kurutucudan çıkardıktan sonra, burada elimizde kalanın, yapışkan olmayan bir PDMS katmanında üç mikron x 10 mikron derinliğinde bir dizi olduğunu görebilirsiniz.

Mpad alt tabakaları için kullandığımız dikey konsolları yeniden oluşturmak için, aynı PDMS karışımımızı kullanarak bundan tekrar atmak gerekir ve bu da bize, daha önce ürettiğimiz silikon master'ı aynı şekilde yansıtan pozitif bir bağımsız elastomerik konsol dizisi bırakacaktır. Bu prosedürün ilk adımı, yapışkan olmayan negatif kalıplarımızı PDMS şeritlerinden ve bir cam mikroskop lamından yaptığımız bir montaj aparatına aktarmaktır. Bu teçhizatın nedeni bir sonraki adımda netleşecek.

Bu noktada, negatif kalıplarımızın her birinin üst yüzeyine zaten Degas'ı çapraz bağlamak için aynı 10'a bir PDMS karışımından küçük bir damla bırakabiliriz. Negatif kalıpların kenarına akmaması için sadece az miktarda PDMS'ye ihtiyaç vardır. Bu noktada.

PDMS'yi kalıpların üst yüzeyine daha tam olarak yaymak için, forseps kullanarak bir tane alabilir, ters çevirebilir ve tüm alt tabakayı tamamen kaplamak için PDMS'nin etrafına dikkatlice yayılan bitişik kalıpla temas ettirebiliriz. Bu adımda, üst PDMS çözeltisine daha fazla kabarcık sokmamak için çok dikkatli olun, daha sonra diğer iki kuyucuk, diğer iki kalıp ile tekrarlanabilir. Artık üst yüzey boyunca daha düzgün bir PDMS kaplamaya sahip olduğumuza göre, negatif kalıplarımızın üzerindeki PDMS filmine sıkışmış olabilecek kabarcıkları daha da çıkarmak için bu aparatı bir vakumlu kurutucu içine yerleştirebiliriz.

Bu işlem genellikle yaklaşık 30 dakika sürer. Negatif kalıplarımız gazdan arındırılırken, pedler için son montaj yeri olacak olan 22 x 22 milimetre cam alt tabakaları temizleyebiliriz. Bu işlemin ilk adımı, sıkıştırılmış nitrojen kullanarak toz parçacıklarını üflemektir.

Cam kapak kaymalarını gaz plazmasına maruz bırakacağız, bu da yüzeyi külleyecek ve bir sonraki adımda yapıştıracağımız PMS'ye daha yapışkan hale getirecektir. PDMS'nin üst tabakasının yaklaşık 30 dakika boyunca DGA'lara izin verdikten ve cam kapak fişlerini plazma aktive ettikten sonra, şablonumuzu çıkarabilir ve gaz plazmasına maruz kalmış cam kapak astarlarının üst yüzeyini negatif kalıpların üstündeki PDMS tabakası ile temas ettirebiliriz. Tipik olarak, önce cam kapak kaymasının bir kenarının PDMS ile temas etmesine ve ardından cam kapak kaymasının geri kalanının bir SH'ye yerleşmesine izin verilmesine yardımcı olur, böylece PDMS levha benzeri bir şekilde yayılır.

Bu, PDMS filmine giren kabarcıkların azaltılmasına yardımcı olur. Bu noktada, fazla PDMS'yi dışarı itmek için forsepslerimizle cam kapak kaymasının üst yüzeyine hafifçe bastırabilir ve ayrıca kapak kızağını şablonun ortasındaki PDMS çaprazına doğru itebiliriz. Bu, PDMS sertleşirken kapak kaymasının hareket etmesini önleyecektir.

Bunu diğer yüzeyler için de tekrarlıyoruz. Bu noktada şablonun tamamını fırına aktarıp 110 derecede 22 saat pişirebiliriz. Tüm düzeneğin oda sıcaklığına soğumasına izin verdikten sonra, alt tabakalarımızı çıkarabilir, ters çevirebilir ve negatif kalıbı cam kapak kızağından dikkatlice soyabiliriz.

Direklerin ezilmesini veya cam alt tabakadan yırtılmasını önlemek için bunu yavaş ve düzgün bir şekilde yapmak önemlidir. Negatif kalıbı soyduktan sonra, Silicon Master'ı tam olarak taklit eden bir dizi konsol ile baş başa kaldığımızı görebiliriz, ancak şimdi içindeler, esnek bir PDMS elastomerinden yapılmışlardır. Tamam, bu noktada size Emad alt tabakalarımızın Silicon Master'ını nasıl oluşturduğumuz konusunda yol gösterdik.

Daha sonra, A-P-D-M-S elastomerik polimer kullanarak tam bir kopya oluşturmak için bir replika kalıplama işlemi kullandık, böylece konsollar artık hücrenin yayılmasına, büzülmesine ve işlem sırasında konsolları saptırmasına izin verecek şekilde esnektir. Bu noktada, substratlarımız hücre kültürü için işlenmeye hazırdır. Artık eds'yi yapmak için kalıpların nasıl üretileceğini ve çoğaltılacağını gördüğümüze göre, EDS'yi işlevsel hale getirmek için birkaç adım daha atacağız, böylece kendimizi kültürleyebilir ve ardından çekiş kuvvetlerini analiz edebiliriz.

Ama bunu yapmadan önce üç şey yapmamız gerekiyor. Direklerin uçlarını hücrelere yapışık hale getirmemiz gerekiyor. İkinci olarak, post sapmaların görselleştirilmesine ve analizine yardımcı olmak için PDMS'yi floresan olarak etiketlememiz gerekir.

Üçüncüsü, direklerin yan duvarlarını ve direklerin tabanını hücrelere yapışmaz hale getirmemiz gerekiyor, böylece çekiş kuvvetleri sadece direk uçlarına uygulanıyor. Dolayısıyla bu adımların mikro temaslı baskı tabanlı strateji ile nasıl ilerlediğini ilerleyen dakikalarda göreceğiz. Ama önce, bir sonraki adım, eds'deki fazla P-D-S-P-D-M-S'yi temizlemektir.

Bahsettiğim gibi, ilk adım, West'in size onları nasıl oluşturacağınızı ve kırpacağınızı gösterdiği EDS alt tabakasını almaktır. Cam kapağın kürlenmesinden kaynaklanan fazla PDMS, negatif kalıba karşı kayar ve keskin bir tıraş bıçağı kaplaması kullanılır. Fazla PDMS, bunu, tıraş bıçağını sütunların kenarındaki alt tabakaya dikey olarak indirerek ve ardından kazıyarak yaparsınız.

Ve kapak fişinin hareket etmemesi için kapak fişini yerinde tutmak için bir parmağınızı kullanabilirsiniz. Böylece elde ettiğimiz şey, kalıntılardan arındırılmış ve böylece kolayca erişilebilir olan bir M pedi alt tabakasıdır. Bu nedenle, bir sonraki adım için, mikro temas kurmalı, direklerin uçlarını yapışkan hale getirmek için DKA'ları yazdırmalıyız.

Bunu yapabilmek için öncelikle pul oluşturmamız gerekiyor ve bu işlem çok kolay. PDMS'yi 10'a bir oran, bir ila 30'a bir oran yerine karıştırıyoruz. PDMS yüksekliği yaklaşık bir santimetre olacak şekilde bir Petri kabına döküyoruz.

Bırakın gazını alsın. Yani, kabarcıkların PDMS'nin tepesine çıkmasına izin verin ve yemeği fırından çıkarıp soğumaya bıraktıktan sonra bir saat boyunca fırında 60 derecede çapraz bağlama reaksiyonunu sertleştirin, şimdi pulları kesmeye hazırım. Bu yüzden yine, aynı tür tıraş bıçağıyla, Petri kabının dibine temas edene kadar PDMS'ye dikey olarak aşağı doğru bastırarak kesin.

Şimdi pulun oryantasyonu, dikkat etmek istediğimiz bir şey. Damga yüzeyi, PDMS'nin Petri kabının dibine karşı dökülen tarafı olacak, böylece düz kalacak. Kesip çıkardığım bu büyük PDMS karesinde, damga yüzeyi artık yukarı bakıyor.

Şimdi bu damga M pedlerinden çok daha büyük, bu yüzden jiletle keserek tekrar tek bir M pedi boyutuna indirgeyeceğim, çünkü damganın doğru yönünü gözle söylemek çok zor olduğu için, damganın arka tarafına, yani yüz olmayan tarafa küçük bir çentik koyacağım. Ve daha sonra damgayı daha büyük levhadan çıkarabilirim. Ve şimdi bir sonraki adım için A-P-D-M-S damgam var.

PDMS damgalarını temizlemek istiyoruz. Atmosferden gelen tozun PDMS damgalarını keserken üzerine çökmüş olması çok muhtemel olduğu için. Bu, bu kristalizasyon kabına istenen sayıda PDMS damgası koyduğumuz ve kristalizasyon kabını %100 etanol ile doldurduğumuz bir işlemdir.

Bu nedenle, pulların yüzünü kaplayacak kadar etanol ekleyin, ancak eklenen etanolün tam miktarı önemli değildir. Ve sonra kristalizasyon diskini bir atora yerleştirin ve pulları beş dakika boyunca sonikleştirin. Beş dakika dolduktan sonra, pulları sterilize etmeyi bitireceğiz ve M pedlerinin steril bir doku kültürü başlığında işlevselleştirilmesi olan mikro temas baskısının geri kalanını yapacağız.

Şimdi pulları sterilize etmeyi bitirebileceğimiz doku kültürü davlumbazındayız. Bunu yapmak için, kristalizasyon kabından pulları alıyoruz, kalan kalıntıları durulamak için etanol dolu bir kaba batırıyoruz ve son olarak etanolü durulamak için bir su kabına batırıyoruz. Daha sonra bir nitrojen akışıyla, artık görünür damlalar kalmayana kadar pulları kurutuyoruz.

Yani bir sonraki adımda, pulları bir protein çözeltisi ile mürekkeplememiz gerekiyor. Kullandığımız protein çözeltisi, DEI suyunda mil başına 50 mikrogram fibrindir. Protein çözeltisinin bir kısmını pipete alın ve protein çözeltisinin damlalarını damga yüzeyine yerleştirin.

Bunu, damga yüzünün kenarına küçük damlacıklar yerleştirerek yapmak istersiniz. İlk olarak, kullanacağınız tüm pullar için bunu tekrarlayın ve bunu önceden yapmalıydım. Bu nedenle, tüm damgaların kenarlarına noktalar yerleştirdikten sonraki adım, bu damlacıkları birleştirmek ve damga yüzündeki protein solüsyonunu doldurmaktır.

Bunu yapmamızın nedeni, damlacıklardaki protein çözeltisinin ve damlacıkların altındaki sonun damga yüzeyini hidrofilik hale getirmesi ve hücre dışı matris proteininin yayılmasını kolaylaştırmasıdır. Bu yüzden, protein solüsyonunu pulların yüzüne yaydığımıza göre, şimdi kullandığınız tüm pullar için bunu tekrarlayın, pulları mürekkeplemenin son adımı kenarların kaplandığından emin olmaktır. Bunu yapmak için, bir pipeti açılandırıyoruz ve hem PDMS damgasının köşesi hem de protein çözeltisi ile temas edecek şekilde damga yüzü boyunca gezdiriyoruz.

Ve yine, mürekkeplediğiniz tüm damgaların tüm kenarları için bunu tekrarlayın. Artık pulları mürekkeplemeyi bitirdiğimize göre, bu pulları yerleştiriyoruz, proteinin damga yüzeyine tam olarak emilmesini kolaylaştırmak için pulları bir saat boyunca doku kültürü başlığında bırakıyoruz. Proteinlerin depolanması için bir saat beklediğimize, damga yüzeyine emilmesine göre, şimdi onları suyla durulama ve nitrojen ile kurutma zamanı.

Bunu yapmak için steril su alıyoruz ve steril suyu pulları içeren tabağa döküyoruz. Suyu doğrudan damga yüzeyine dökmemeye dikkat edin ve gerekirse bir pipet kullanabilirsiniz. Sahip olduğunuz su miktarının tam olarak ne kadar yüksek olduğu önemli değildir, yeter ki su seviyesini protein çözeltisinin üzerine getirin.

Bundan sonra, steril cımbızla bir damga alın, yeni bir su kabına batırın ve yavaşça azotla kurulayın. Yine, damga üzerinde artık protein çözeltisi damlacıkları görmediğinizde, gördüğünüzde kuru olduğunu anlayacaksınız. Ve bunu işlemekte olduğunuz tüm pullar için teker teker tekrarlayın.

Artık pulları duruladığımıza göre, mpad alt tabakalarını UV ozon ile işlemden geçirerek etkinleştirmenin zamanı geldi. Yedi dakika boyunca Petri kabının kapağını üstten, tabağın üstünden çıkarıyorum. Çünkü siz, polistiren UV emici olduğu için, daha sonra tabağı UV ozon arıtıcısına yerleştiriyorum, çekmeceyi kapatıyorum, süreyi yedi dakikaya ayarlıyorum ve gitmesine izin veriyorum.

Şimdi doku kültürü başlığına geri döndük ve UV ozon ile yeni işlem görmüş olan mpad substratlarını damgalamanın zamanı geldi. Bunu yapmak için, durulanmış ve kurutulmuş pullarımızı forseps ile kaldırın. Pulları yanlarından tutabilirsiniz, ancak damganın yüzüne dokunmayın.

Forsepsteki damgayı, protein tarafına erişilebilir olacak şekilde ayarlamak istiyorsunuz. Daha sonra, protein tarafının aşağı dayandığını ve damgayı yavaşça eds ile temas ettirdiğini akılda tutarak forsepsleri ters çevirin. Bir ila 30 pul oldukça yapışkandır, bu nedenle damgayı forsepsten çıkarmak için ikinci bir cımbız kullanmanız gerekebilir.

Damgayı yaklaşık iki milimetre yükseklikten yaklaşık sekiz milimetreye kadar emedlerin üzerine bırakabilirsiniz. Daha sonra emedlerin kabını yukarı eğin ve damga ile eds arasında temas oluşturmak için forseps ile hafifçe bastırın. Temasın ne zaman yapıldığını iki yoldan biriyle bileceksiniz.

Birincisi, damganın yanından ED yüzeyine bakmaktır. Bunu kamerada görmek zor olabilir, ancak gözle damganın yüzeyle temas ettiğini, damganın yanından yüzeye bakarak açıkça görebiliyorum. P ile teması sağlamanın ikinci yolu, Petri kabını kapağı kapalı olarak doku kültürü başlığından çıkarmak ve ters mikroskop altında görüntülemektir.

Mikroskopla girişim desenlerini görselleştirerek, damganın eds ile ne zaman, ne zaman ve ne zaman temas halinde olduğunu anlayabilmelisiniz. Teması belirledikten sonra, damganın bununla sadece birkaç saniye boyunca ed alt tabaka ile temas halinde kalması gerekir. Bu yüzden şimdi damgayı çıkarmanın zamanı geldi.

Bunu yapmak için, Eds'i bir cımbızla katlayın ve tek bir yumuşak hareketle damgayı soyun. Hangi eds'leri damgaladığınızı ve daha önce hangi pulları kullandığınızı takip ettiğinizden emin olun. Ve kullanmak istediğiniz her alt tabaka için bu prosedürü EMPA başına bir kez tekrarlayın.

Artık EMPA'ları damgaladığımıza göre, bir sonraki adım onları sterilize etmek ve daha sonra boya gözü adı verilen lipofilik bir boya içinde inkübe etmektir. Dai, floresan olarak etiketlenmiş lipofilik bir moleküldür, bu nedenle zamanlanmış süre boyunca PDMS'ye yayılır ve bu da mikroskop altında sapmaları görselleştirmemizi sağlar. Bu yüzden yapacağım şey, her bir empa substratını birer birer almak ve %100 etanol, %70 etanol, DI su, DI su, DI su, DI su, DI su, DI suya batırmak.

Ve son olarak, mil başına beş mikrogram dii çözeltisi. DII çözeltisi floresandır, bu nedenle ortam ışığına maruz kalmasını en aza indirmek ve foto ağartmasını en aza indirmek için, bulaşıkları doku kültürü davlumbazında bir saat inkübe ederken alüminyum folyo ile kaplıyoruz. EM pedlerinin DAI solüsyonunda inkübe etmesi için bir saat beklediğimize göre, alüminyum folyoyu çıkarabilir ve DAI solüsyonunu durulayabiliriz.

Sterilize suya üç ardışık daldırma yaparak duruluyoruz ve son olarak %0.2 onik F1 27 çözeltisine daldırıyoruz. Bu, hacim başına %0,2 ağırlıktır Tüm daldırma adımları sırasında, EM pedlerinin havaya maruz kalma süresini en aza indirmek önemlidir. Bu, ED alt tabakalarının hasar görmesini önlemek ve özellikle iki direğin birbiri üzerine çökmesini önlemek içindir.

%0.2 onik F1 27, hidrofilik ve hidrofobik alanlardan oluşan üç bloklu bir kopolimerdir. Hidrofilik alanın protein emilimine ve dolayısıyla hücre yapışmasına direndiği bilinirken, hidrofobik alan öfkeye ve hidrofobik PDMS'ye bağlanır. Böylece, PDMS F1 27'ye batırıldığında, F1 27 PDMS'ye bağlanır ve hücre yapışmasını iter.

Alüminyum folyo kaplı bir Petri kabında kronik F1 27'de bir saatlik inkübasyondan sonra, F1 27'yi steril suya, steril suya ve PBS'ye sırayla daldırarak durulayabiliriz. PBS'ye daldırıldıktan ve F1 27 ürünü durulandıktan sonra, alt tabakaları eds'yi tercih edilen hücre kültürü çözeltisine daldırabiliriz. EMPA'ları yeni daldırdığım hücre kültürü çözeltisi, serum ve/veya diğer büyüme faktörleri ve/veya penisilin ve streptomisin gibi takviyeler içerebilir.

Bu bileşenlerin tümü EMPA tedavileri ile tamamen uyumludur. Şimdi bir sonraki adım, ed'ler hücre kültürü çözeltisine daldırıldıktan sonra, tercih edilen hücreleri eds'e tohumlamaktır. Bu özel deney düzeneği için, sığır pulmoner aort endotel hücrelerini üç farklı tabağa ekeceğim.

Üç farklı tabak kullanmamın nedeni, daha sonra tahlil yapabileceğimiz gibi, direklerin sapmalarını önlemek için tabaklardan ikisine bilinen dokunsallık inhibitörleri uygulayacak olmamdır. Bu yüzden hücreleri tohumlamak için, sadece hücre süspansiyonumu alıyorum, uygun miktarı pipete çekiyorum ve her bir tabağa damla damla pipetliyorum. Yeterince hücre ekliyorum, böylece çekiş kuvvetlerini ölçmek için tahlil yaptığımda, hücreler eds üzerinde tek hücreli hücreler olarak var oluyor.

Ekleyeceğiniz miktar, yayılma alanına ve belirli hücrelerinizin büyüme hızına bağlı olacaktır. Tipik olarak, substratın santimetre karesi başına 1500 ila 5.000 hücre arasında tohum ekeriz. Hücreleri tohumlamayı veya hücre süspansiyonunu düzenlemeyi bitirdikten sonra, hücre süspansiyonunu kültür kabına karıştırmak için kültürü ortogonal yönlerde birkaç kez hafifçe ileri geri sallayın.

Kullanmakta olduğunuz tüm alt tabakalar için bu işlemi tekrarlayın. Hücreleri tohumladıktan hemen sonra, pH'ı ve hücre kültürü ortamını tamponlamak için uygun bir karbondioksit seviyesinde 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin tohumlanmasından iki saat, yaklaşık iki saat sonra, substratları bir ortam kabından aynı hücre kültürü ortamının taze bir kabına aktararak hücrelerin durulanması uygundur.

Bu durulamanın nedeni, çoğu hücrenin yayılmaya başlaması ve neredeyse son yayılma alanlarına iki saat içinde ulaşmış olmasıdır. Hücreyi, substratları durulayarak, yüzen hücreleri hücre kültürü ortamından çıkarıyorsunuz. Bu şekilde, yalnızca EDS'ye bağlanmış ve yayılma sürecine başlayan hücreler, çekiş kuvvetleri için son nokta tahlilinde görünecektir.

DKA'lar üzerinde kültürlenmiş hücrelerle yapabileceğimiz bir test, hücresel kasılma dinamiklerini kantitatif olarak incelemek için hızlandırılmış görüntülemedir. Özellikle, çözünür faktörlere yanıt olarak hücresel kasılma dinamikleri ilginçtir. Biyolojik bileşikler ve sentetik bileşikler gibi çözünür faktörlerin arttığı, azaldığı veya hücresel kasılma üzerinde bilinmeyen etkileri olduğu bilinmektedir.

Bu canlı hücre deneyi için, bu ters çevrilmiş epi floresan mikroskobunu kullanacağız. Mikroskop sahnesinde, sıcaklığı %5 CO2 ile 37 santigrat derecede tutmak için bir termal regülatöre bağlanmış küçük bir inkübatör kutum var. 60 x plan APO objektifi ile yüksek büyütme oranında görüntüleme yapacağız.

Şimdi görüntüleme için darbe alt tabakasını hazırlayacağız. Görüntüleme için kullandığımız 60 x objektif, 200 mikronluk bir çalışma mesafesine sahiptir, bu da hücreleri daha önce ektiğimiz doku kültürü kabının kalınlığından çok daha incedir. Bu nedenle doku kültürü kabındaki implantların üzerindeki hücreleri görüntüleyemiyoruz, görüntüleyemiyoruz.

Bu sorunu aşmak için bu cam tabanlı tabakları kullanıyoruz. Şimdi alt tabakayı baş aşağı cam alt tabağa aktaracağım, böylece hücreler ve direklerin uçları cam Alt tabağın arayüzünde olacak. Bu nedenle, bu mikroskoba yerleştirildiğinde, hücreler ile objektif arasındaki çalışma mesafesi 200 mikrondan azdır.

Şimdi bunu görüntüleme için mikroskoba koymaya hazırız. Şimdi canlı hücre inkübatör odasını açacağım, numuneyi içine yerleştireceğim ve inkübatör haznesi kapağını değiştireceğim. Bu noktada, uygun bir hücre için alt tabakayı tarayacağım.

Resme. Bunu yapmanın en etkili yolu, substratın daha geniş bir alanını görmemi ve bir hücreyi daha hızlı bulmamı sağlayacak bir yüz fazı 10 x objektif kullanmaktır. İyi hücre için kriterim tek bir hücre içindir.

Herhangi bir komşu hücreye dokunmamalı ve ayrıca substrattaki diğer tüm hücrelere kıyasla ortalama boyutta olmalı, bakmak için uygun bir hücre buldum. Yapacağım bir sonraki şey, hücreye yüksek büyütmede bakmak için hedefi 60 x'e çevirmek. Bunu yapmak için, hedefi bulanıklaştırırız, böylece dönüş sırasında sahneyi çarpmamak olur.

Tareti döndürürken odayı açın, 60 x objektif röportajını kısmen döndürün 60 x 60 x objektif bir yağa daldırma merceğidir, bu nedenle objektif merceğine bir damla daldırma yağı koymamız gerekir. Şimdi 60 x'i yerine getirmek için turtu döndürmeyi bitireceğiz. Kuluçka odasını kapatacağız ve hücreyi tekrar odak noktasına getirmek için hedefi yeniden odaklayacağız.

Hücrenin konumunu ve odağını ince ayarladıktan sonra, hücreyi bilgisayar ekranında önizlemek ve ardından hızlandırılmış görüntülemeyi başlatmak için CCD kameraya geçeceğim. Bu deney için, bir dakikalık aralıklarla hem faz hem de floresan görüntüleri toplayacağım, yani hızlandırılmış görüntüleme başladı ve 10 dakika veya 10 kare boyunca çalışmasına izin vereceğim ve bu noktada serum ekleyeceğim 10 dakika geçti. Şu anda, hücredeki kasılmayı uyarmak için odayı açacağım ve tabağa serum ekleyeceğim.

Zamanlayıcı hala çalışıyor, bu yüzden bunu yaparken hızlı olmalıyım Şimdi, kasılmadaki herhangi bir değişikliği takip etmek için hücreyi 30 dakika boyunca görüntülemeye devam edeceğiz. Hızlandırılmış görüntülemeyi bitirdikten sonra, görüntüler gösterilen bir filme sıralanabilir. İşte faz ve floresan görüntülerinin iki filmi.

Solda, siyahla özetlenmiş, çoğunlukla saydam bir hücrenin bir faz filmi var. Hücre, dikdörtgen bir kafes şeklinde düzenlenmiş dairesel yapılar olan 20 direğin uçlarına yayılmıştır. Sağda aynı hücrenin floresan bir filmi var, ancak yalnızca gönderiler görünüyor.

Bu filmleri oynatırsam, hücreye bağlı direklerin başlangıçta zayıf olduğunu, saptığını ve dikdörtgen kafesten çok az saptığını göreceksiniz. Filmin ortalarına doğru medyaya serum ekledim. Serum, hücreyi kasılmada artması için uyarır.

Hücre, alttaki direklere daha fazla çekiş kuvveti uyguladıkça, hücrenin çevresi boyunca direkler içe doğru sapmaya başlar. Floresan filmde, artık direklerin dikdörtgen kafes içindeki konumlarından önemli ölçüde saptığını görüyorsunuz. Daha sonra açıklayacağım gibi, bu görüntülerdeki bu direk konumlarının yer değiştirmesi, bu hücrenin çekiş kuvvetlerini analiz etmek için kullanılabilir.

Daha önce, mpad substratlarını nasıl oluşturduğumuzu ve hücreleri kültürlemek için bunları nasıl işlevselleştirdiğimizi gördük. Şimdi, bitmiş mpad substratlarını üç farklı hücre kültürü kabına yerleştirdiğimi fark etmişsinizdir. Hücreler bir gecede büyüyor ve şimdi yapacağım şey, her bir hücre kültürü çanağına, kasılmayı bilinen bir şekilde modüle eden farklı bir çözünür ajan ile muamele etmek.

Daha sonra, hücreleri 30 dakika kadar sabitledikten sonra ortaya çıkan çekiş kuvvetlerini nicel bir şekilde ölçebiliriz. Kasılma inhibitörlerini ekledikten 30 dakika sonra çözünür faktörleri ekledikten sonra, şimdi mevcut çekiş kuvvetleri durumunu kilitlemek için hücreleri paraform aldehit ile sabitlemenin zamanı gelmiştir. Bunu yapmak için, kalsiyum ve magnezyum içeren paraform aldehit kullanmak önemlidir ve %3,7'lik bir hacim yüzdesinde paraform aldehit kullanıyoruz.

Yani, alt tabakaların kurumasına izin vermemek önemlidir, çünkü bu çökme sonrası ortaya çıkabilir. Aktardıktan sonra, substratları aktardım, 20 dakika paraform aldehit içinde inkübe etmelerine izin verdim. 20 dakika dolduktan sonra, substratları şimdi paraform aldehitten çıkarıyoruz ve şimdi hücreler sabitlendiğine göre, bu örnekleri standart immün boyama için işleyebiliriz.

Bunu yapmak için, alt tabakaları yüzü yukarı bakacak şekilde param üzerine yerleştiriyoruz ve alt tabakayı kaplayacak ve PBS'nin altında tutacak kadar PBS'ye pipetliyoruz. Daha sonra, kültürde kalabilecek herhangi bir paraform aldehiti uzaklaştırmak için bir substratı PBS ile üç kez durulayın. Substratı PBS ile üç kez duruladıktan sonra, substratı aşağı akış immüno-boyama için aktarabiliriz.

Bunu, substratı bir cımbızla tutarak ve immüno-boyamanın ilk adımında ters çevirerek yapıyoruz ve bu bir nüfuz etme maddesidir. Bu durumda, PBS'de %0.2 Triton X kullanıyoruz. Bununla birlikte, kullanıcı ihtiyaçlarına en uygun olan herhangi bir leştirme aracısını kullanabilir.

Bunu tüm substratlarımız için tekrarlıyoruz ve immüno-boyama işlemi sırasında substratları bu şekilde ele alıyoruz. İmmüno boyamayı takiben, substratlar standart bir inç x üç inç cam slayt üzerine monte edilir, bu daha sonra ters veya dik olsun, herhangi bir epi floresan mikroskobu üzerinde işlenebilir. Numuneleri konfokal bir mikroskopta işleyerek, boş pozisyonlar olan saptırılmamış pozisyonları elde etmek için direklerin altına odaklanabiliriz.

Daha sonra direklerin uçlarına odaklanabilir, direklerin başka bir görüntüsünü yakalayabiliriz ve üst ve alt görüntüyü karşılaştırarak, direklerin sapmalarını ölçebilir ve hücrelerin bu tür sapmaları üretmek için oluşturduğu hücrelerin çekiş kuvvetlerini hesaplayabiliriz. Bu işlemi birkaç farklı koşulda birçok farklı hücre için yaparak, farklı koşullarda üretilen çekiş kuvvetlerini karşılaştırabiliriz. Artık hem canlı hem de sabit hücrelerin görüntülerini topladığımıza göre veya bir sonraki görev, hücrelerdeki çekiş kuvvetlerini ölçmek için sapmayı ölçmektir.

Bunu yapmak için, bunu yapmak için matlab'da bir bilgisayar programı yazdık. Bunlar, bu analizde kullanacağımız üç görüntüdür. İlk görüntü, hücrenin bir faz görüntüsüdür.

Hücrenin yerini belirlemek için yararlıdır. İkinci görüntü, direklerin üst kısımlarının floresan bir görüntüsüdür. Bu görüntüyü, uçlarındaki direklerin konumlarını bulmak için kullanıyoruz.

Gördüğünüz gibi, bu direklerden bazıları, bu direklerin çoğunun bulunduğu dikdörtgen kafesten saptırılır ve sapar. Ve bu yazı. Kullanacağımız üçüncü görüntü, direklerin tabanlarından geçen bir odak düzlemindeki konumunu yakalayan temel görüntüdür.

Bu seviyede, hem saptırılmış hem de saptırılmamış direkler, dinlenme pozisyonlarında, un, saptırılmamış pozisyonlarında bulunmalıdır. Dikdörtgen kafeste, ikinci resimde saptırılan direklerin tabanlarında FL konumlarında olduklarını görebilirsiniz. Bu görüntü, gönderinin konumunu bulmak için kullanılır, bu, yansıtılan konumun altındadır.

Ardından, bu üç görüntüyü yüklememizi isteyecek olan MATLAB programını yüklüyoruz. Dosyaya bir ad verin. Faz görüntüsünü görüyorsunuz.

Hücrenin nerede olduğunu gösteren bir kutu çizeceğiz, böylece program hangi gönderileri analiz edeceğini bilir. Program daha sonra gönderilerin OID koordinatlarını belirlemek için kırpılan görüntünün yoğunluğunu, eşiğini ve izasyonunu gerçekleştirir. Solda, en üstteki görüntüdeki gönderilerin görüntüleri görüntülenirken, sağda temel görüntüdeki aynı gönderilerin görüntüleri görüntülenir.

Direkleri elde ettikten sonra, OID koordinatları, program daha sonra her bir direğin ucu ve tabanı arasındaki yer değiştirme vektörlerini belirleyebilir. Bu yer değiştirme sonrası vektörler, direğin yay sabiti ile çarpılarak kuvvet vektörlerine dönüştürülebilir. Bu hücresel kuvvetleri, hücre başına ortalama kuvvet veya post başına ortalama kuvvet gibi çeşitli şekillerde analiz edebiliriz.

Yararlı bir sonuç, kuvvetlerin uzamsal dağılımını görselleştirebileceğimiz bir titreme grafiğidir. Bu az önce analiz ettiğimiz hücre ve gördüğünüz gibi, kuvvetin büyüklüğü ile ilişkili olan ve kuvvetin yönünü gösteren direklerin üzerine sarı oklar koydum. Zaman atlamalı filmimizde gerekli olanlar gibi dizi görüntüleri için bu görüntü analiz işlemini tekrarlayarak, zamansal bir dizi oluşturabiliriz.

İşte serumla uyardığımız hücrenin bir filmi. Gördüğünüz gibi, serum eklendiği gibi, hücre kasılmayı arttırdı ve direkleri daha da saptırdı. Ek olarak, farklı koşullara maruz kalmış ve daha sonra kasılma inhibitörleri ile muamele edilmiş hücrelere karşı bir kontrol bileşiği ile muamele edilmiş bir hücreyi gösteren bu titreme grafikleri ile örneklendiği gibi boyanmış daha fazla sayıda hücre için kuvvetleri ölçebiliriz.

Yapabildiğin gibi. Gördüğünüz gibi, kontrol durumunda hücre üzerindeki kuvvet vektörleri, kuvvet vektörlerinden büyüklük olarak daha büyük olandan daha büyüktür. Kasılma inhibitörlerinin kullanıldığı iki durumda, bu substratların çok yönlülüğünü göstermek için mikro fabrikasyondan numune hazırlamaya, deney ve analize kadar yol substratını tanımlamak için burada çok sayıda malzeme materyalini ele aldık.

Canlı hücre görüntüleme ve sabit numune tahlili olmak üzere iki farklı tahlil tanımladık ve bu tahlillerin her ikisinden elde edilen hücrelerin analizini yaptık ve titreme grafikleri ve titreme filmleri gösterdik. Bu güçlü araçla, hücre kontraktilitesinin çeşitli mekansal ve zamansal analizi yapılabilir. Gördüğünüz gibi, bu yöntem mikro fabrikasyon, temel hücre biyolojisi, yüzey bilimi, görüntü analizi ve işleme ve diğerleri dahil olmak üzere birçok farklı disiplinden yararlandı.

Ve tam da yönteminin birkaç farklı mühendislik tekniğine dayanması nedeniyle, post geometri, indüklenen çözünür faktörler ve post sapmaları analiz etme yöntemleri gibi parametreler kullanıcının ihtiyaçlarına bağlı olarak özelleştirilebilir. Geçtiğimiz 20, 30 dakika içinde ana hatlarıyla belirttiğimiz bu yöntemin görsel gösteriminin, hücresel çekim kuvvetlerinin düzenlenmesi, işlevsel sonuçları ve oluşumu ile ilgili diğer ve daha derin analizler için bir başlangıç noktası olarak kullanılabileceğini umuyoruz.