Microfabricated Post-Dizi-Dedektörleri (mPADs): Mekanik Kuvvetleri yalıtın bir Yaklaşım

Merhaba, ben Nathan Snia Decky; bugün yanımda Wes Ligan, Robbie Desai ve Mike Yang var. Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Chris Chen laboratuvarından geliyoruz. Bu videoda, mikro imalatla üretilmiş bir direk dizisi kullanarak hücresel çekim kuvvetlerini ölçme yaklaşımımızı sunacağız.

Traksiyon kuvvetleri, miyozin ve aktin etkileşimleri aracılığıyla üretilir ve fizyolojimizde önemli bir rol oynar. Gelişim sırasında bu kuvvetler, dokularımızın erken yapılarının oluşması için hücrelerin bir konumdan diğerine hareket etmesini sağlar. Ayrıca, yaraların kapanması veya lökositlerin vücut içinde göç etmesi ve sürünmesi için gerekli olduklarından, iyileşme sürecine de yardımcı olurlar.

Ancak ne yazık ki, aynı kuvvetler kanser metastazı veya bir tümöre doğru gelişen vasküler büyüme durumlarında sağlığımız için zararlı olabilir. Bu nedenle, bu traksiyon kuvvetlerini nicel bir şekilde, özellikle de tekil hücrelerin mikro ve nano ölçeğinde gerçekten ölçebilen çok az yöntem bulunmaktadır. Hücreleri in vitro incelemek için kullanılan yaygın yöntemlerin çoğu cam tabanlı kaplar veya polistiren kaplar ile gerçekleştirilmiştir; fakat bunlar çok sert substratlardır ve hücrenin neden olduğu traksiyon kuvvetlerini ve deformasyonları fiziksel olarak ölçmemize olanak tanımazlar.

Bu nedenle, herhangi bir fiziksel çıktı olmadan traksiyon kuvvetlerinin altında yatan mekanizmaları anlamak oldukça zor olmuştur. Chris Chen'in laboratuvarında bu sınırlamaları aşmamıza olanak tanıyan bir tekniğimiz bulunmaktadır. Yöntemimiz, sertlik ve boyut ölçeği, tekil hücrelerin birden fazla konsol üzerinden yayılmasına ve bu süreçte onları bükmesine imkan veren esnek konsollardan oluşan dikey bir diziye dayanmaktadır.

En sık kullandığımız boyutlar; 3 µm çapında, silindirik destekler, 10 µm yükseklik, 9 µm merkezden merkeze mesafe ve dikdörtgen bir dizilimdir. Ancak, bu boyutlar çeşitli hücresel çalışmalara uyum sağlamak için değiştirilebilir. İşleme, burada gördüğünüz sert bir silikon kalıpla başlar ve ardından bunları burada gördüğümüz esnek PDMS konsol kirişlere dönüştürürüz.

Bu tekniği kullanarak, mikroskop altında tekil konsol sapmalarını ölçebilir ve bu sapmaları oluşturmak için gereken büyüklük ve yöndeki hücresel traksiyon kuvvetlerini hesaplayabiliriz. Bu substratları, mikro post dizi dedektörleri olan M pedlerine dönüştürdük; bu videoda, silikon kalıptan başlayıp PDMS replikasyonuna ve son olarak modülasyon ile hücresel kontraktilite hesaplamalarına kadar M pedlerinin nasıl üretileceğini göstereceğiz. Merhaba, şu an laboratuvarımızın temiz odasındayız.

Burası, silikon kalıp görevi görecek olan SU-8 sütunlarını yapmamıza olanak tanıyan, tozsuz ve ışığa duyarlı bir odadır. İlk olarak bir silikon gofret ile başlayacağız ve bunun üzerine SU-8 fotoresist kaplayacağız; SU-8 negatif bir resisttir ve ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, bu fotomaske üzerinden ışık tuttuğumuzda, ışık mikro sütunları desenleyeceği ve ardından üç boyutlu bir yapı oluşturacağı için, bunlar daha sonra PDMS içinde dökümünü gerçekleştireceğimiz SU-8 sütunları olacaktır.

Tüm işlemler tamamlandıktan sonra, wafer mikro sütun ve mikro direk yapıları üzerinde halihazırda oluşturulmuş şekilde görünecektir. Master'ları hazırlamak için öncelikle çıplak bir silikon wafer ile başlarız; bu wafer yedi dakika boyunca ozon işlemiyle temizlenmiş ve ayrıca 120 °C'de 30 dakika boyunca susuzlaştırılmıştır. Direkler için çok ince bir taban katmanı oluşturmak amacıyla bunun üzerine SU-8 2002 kaplayacağız.

SU-8 kaplayacağımız için gaz maskesi takacağım. Gofreti buradaki tutucuya tekrar yerleştiriyorum, üzerinde olabilecek tüm tozları temizliyorum, döndürücüye yerleştiriyorum, merkezlendiğinden emin oluyoruz ve ardından üzerine SU-8 2002 dökeceğiz. Sonrasında gofreti döndürmeye başlayacağız. Daha sonra bunları, yumuşak pişirme için sıcak plakaya yerleştiriyoruz.

Ardından bu işlemi bir dakika boyunca gerçekleştiriyoruz. Daha sonra numuneyi alıp 95 °C'ye ayarlanmış ısıtıcı tabla üzerine aktarıyoruz ve bu işlemi iki dakika boyunca sürdürüyoruz.

İşlem tamamlandığında, bunu alıp maska hizalayıcıda flood maruziyetini gerçekleştireceğiz. Tamam, bu wafer üzerine ilk SU-8 katmanını yeni kapladık ve şimdi mikro sütunlar için ilk taban katmanını oluşturmak amacıyla tüm wafer'a flood maruziyeti uygulamamız gerekiyor. Bu nedenle, 70 millijoule maruziyet sağlamamız gerekiyor.

Bu nedenle, maske hizalayıcımızdaki ışığın gerçek yoğunluğunu ölçmemiz gerekiyor. Ölçer cihazını maske hizalayıcının ağırlık kısmına yerleştiriyoruz. Ardından cihazı ışığa maruz bırakıyoruz.

Burada UV ışığı bulunmaktadır. Silikon gofretini maske hizalayıcıya yüklüyoruz ve maske hizalayıcıya yerleştiriyoruz. Bu kez maske kullanmıyoruz, böylece filmin tamamını pozlayabiliyoruz.

Deklanşörü takalım, pozlama süresini bir dakikaya ayarlayalım ve pozlama işlemini gerçekleştirelim. Bir dakika sonra sistem işlemi tamamladığında, wafer'ı dışarı çıkarabiliriz. Şimdi, pozlama sonrası pişirme işlemini yapmamız gerekiyor.

Böylece plakayı pozladık ve şimdi SU-8'in bu ilk kaplaması için çapraz bağlanma reaksiyonunu gerçekleştirmek amacıyla ısı uygulayacağız. Plakayı bir dakika boyunca 65 °C'deki ısıtıcı plakaya yerleştiriyoruz ve ardından iki dakika için 95 °C'deki ısıtıcı plakaya aktarıyoruz. İki dakikalık işlemden sonra ısıtıcı plakayı kapatıyoruz ve plakanın oda sıcaklığına geri dönmesini bekliyoruz; bu işlem yaklaşık 30 dakika sürer.

Böylece SU-8'in ikinci katmanını wafer üzerine yaymış olduk. Şimdi bunu fotomask aracılığıyla pozlamamız gerekiyor. Bu sefer, derin UV ışığını engellemek için bir UV filtresi kullanacağız.

Bu, temin edebileceğiniz bir Hoya optik camıdır; ancak bu sefer yoğunluğu tekrar ölçmemiz gerekiyor. Bu nedenle, ışık ölçerimizi kullanacağız veya filtrelenen yoğunluğu ölçmek için üstteki filtreyi kullanacağız. Ardından maskeyi maska hizalayıcıya yerleştireceğiz.

Bu şalter, maskeyi yerinde tutan vakumu oluşturur. Ardından bunu maska hizalayıcıya yerleştireceğiz. Daha sonra üzerine filtreyi koyacağız ve ardından wafer'ı yükleyeceğiz.

İyi bir temas olduğundan emin olmak istiyoruz, bu nedenle temas noktasına kadar yukarı kaldırıyoruz ve ardından pozlamaya başlıyoruz. Pozlama sonrası, wafer'ı maske hizalayıcıdan çıkaracağız. Artık seçici olarak pozlanmış alanlarımız var. Bunu, pozlama sonrası fırınlama işlemini gerçekleştirmek için fırına, sıcak plakalara götüreceğiz.

Son pozlama sonrası pişirme işlemini tamamladık ve şimdi üç boyutlu yapıları elde edebilmek için bu gofretin geliştirme işlemini yapacağız. Yapacağımız işlem, pozlanmamış SU-8'i temizleyerek uzaklaştırmak için gofreti PGMEA ile yıkamak ve geliştirmektir. İlk olarak, gofreti bir kap PGMEA içine yerleştiriyoruz ve hafif bir ajitasyonla iki dakika boyunca burada bekletiyoruz.

Bu işlemi iki dakika boyunca bekleteceğim. Ardından, örneği ikinci bir P-G-M-E-A kabına aktaracağız. Bu işlem, SU eight içeren doygun P-G-M-E-A'yı uzaklaştıracaktır.

10 saniye sonra numuneyi IPA içine alacağız. Bu işlem, P-G-M-E-A'yı yıkayarak uzaklaştırır. Numuneyi, yine hafifçe çalkalayarak 20 saniye boyunca burada tutuyoruz.

Şu an elimizde serbest duran sütun yapıları var. Bunları, düşük yüzey gerilimine sahip olan heksana yerleştireceğiz. Birinci ve ardından ikinci heksan içerisinde beş saniye boyunca yıkayacağız ve sonrasında kurutma işlemine hazır olacağız.

Gofret geliştirme işlemini tamamladık; şimdi gofreti bir ısıtıcı plaka üzerine yerleştireceğiz ve sıcaklığı yavaşça 150 °C'ye çıkaracağız. Bu yüksek sıcaklık, SU-8'in daha fazla çapraz bağlanmasını sağlayarak yapısal olarak daha dayanıklı hale gelmesini sağlar ve gofreti bu ısıtıcı plaka üzerinde gece boyunca bekletiriz. Bu süre yaklaşık 14 ila 20 saat arasındadır ve sonrasında ısıtıcı plakayı kapatarak gofretin tekrar oda sıcaklığına soğumasını sağlarız.

Yani yapmamız gereken, bu gofretle daha küçük bir boyuta gelecek şekilde parçalamaktır. Temel olarak bu silikon gofreti kesmek ve sadece buradaki iç desenden oluşan küçük bir çip oluşturmak istiyoruz. Ve bu, epoksi kullanacakları şu yapıya benzer bir şeye benzeyecektir.

Ve bu çipi, şu şekilde bir cam lam üzerine yapıştıracağız. Bu işlem yapısal bir destek sağlar. Bir gofret dilimlemek bir nevi sanattır; ancak yapmanız gereken temel olarak bir elmas kalem kullanmak ve sadece bir kenardan başlamaktır.

Kristal düzlemler nedeniyle, küçük bir çentik açarsınız. Bu işlem bir kırılma oluşturur; ardından bu bölgeye ilgili aletle hafifçe vurabilirim. Bu parçayı soyup ayırabiliriz ve ardından buna benzer küçük bir yapı elde edene kadar burada daha fazla kesim yapabiliriz. Sonrasında silikon çipi hızlıca camın üzerine yerleştirip sabitleyin. Ardından bunun donmasını bekleyin.

Böylece işlem tamamlandığında, şuna benzer bir düzeneğiniz olacak. Silikon kalıbı bu cam lam üzerine monte ettik ve şimdi, daha sonraki aşamalarda bu yapının PDMS'den ayrılmasına yardımcı olacak bir floy kaplaması uygulayacağız. Çipi bu desikatöre yerleştireceğiz ve ardından birkaç damla tri kloro silanı desikatörün içine damlatacağız.

Bu işlemi çeker ocak içerisinde yapıyoruz çünkü işlemin yan ürünü olarak oldukça sert olan hidroklorik gaz açığa çıkmaktadır. Kapağı kapatın, vakuma bağlayın ve ardından vakum açıkken bekletin; tüm silikon gofret üzerinde güzel bir kaplama elde etmek için bunu gece boyunca biriktirmeye bırakıyoruz. Merhaba, ben Wesley Ligan.

Christopher Chen'in laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim. Şu noktada Nate, ED substratlarımız için nasıl silikon kalıp oluşturulacağını size gösterdi. Ancak, bu aracı hücresel kontraktiliteyi ölçmek için kullanabilmemiz için öncelikle sert foto yapıların elastomerik bir silikon polimer kullanılarak kopyalanması gereklidir.

İlk görevimiz, daha önce hazırladığımız silikon kalıbın negatif bir kopyasını oluşturmaktır. Bunu, PDMS veya Polimetilsiloksan olarak adlandırılan bir silikon elastomer kullanarak yapıyoruz. Şimdi, PDMS polimerimize 10'a 1 oranında kürleme maddesi ekliyoruz.

Çözeltinin tartımı tamamlandıktan sonra, PDMS polimerinin ve çapraz bağlayıcı ajanın iyice karıştırılması gerekir. Bu karıştırma işlemi, çözeltiye doğal olarak çok miktarda hava kabarcığı girmesine neden olur. Bu noktada, çözeltinin üzerini açmak ve vakumlu desikatörde gaz giderme işlemi uygulamak gereklidir.

PDMS tamamen gazdan arındığında ve tüm kabarcıklar yüzeye çıkıp patladığında, malzemeyi vakum desikatöründen çıkarabiliriz. Artık PDMS ve çapraz bağlayıcı ajan karışımını, silikon master'ımızın negatif kalıbını oluşturmak için kullanabiliriz. Bunu yapmak için bir pasta kalıbı kullanırız ve monte edilmiş silikon master'ımızı kalıbın merkezine yerleştiririz.

Ardından, ek hava kabarcığı oluşumunu önlemeye çalışarak DGA'lar polimer çözeltisini silikon gofretin üzerine, kabın içine dikkatlice döküyoruz. Genellikle polimeri yaklaşık çeyrek inç kalınlığında dökmeye çalışırız. Bu işlemin karışıma kaçınılmaz olarak birkaç hava kabarcığı eklediğini görebilirsiniz.

Şimdi, kabarcıkların yüzeye çıkıp patlaması için bu kabı yaklaşık 30 dakika boyunca kenara alıyoruz. Bekledikten sonra, PDMS yüzeyinde hâlâ birkaç hava kabarcığı olduğunu görebiliyoruz. Ancak bunlar üst yüzeyde olduğu için, kalan kabarcıkları patlatmak amacıyla şimdi hızlı bir nitrojen püskürtmesi kullanabiliriz.

PDMS ve CROSSLINKER çözeltisini tamamen çapraz bağlamak ve silikon kalıbımızın sert bir negatif şablonunu oluşturmak için, numuneyi 110 °C'de 20 dakika boyunca pişiriyoruz. Silikon tabakanın üzerinde ince bir PDMS tabakası olduğunu görebiliyoruz. İki tabakayı birbirinden ayırmadan önce, bu tabakayı keserek uzaklaştırmak gereklidir.

Ardından, bu üst katmanı aşılayabilir ve silikon alt tabakadan nazikçe soyabiliriz. Bu noktada, negatif silikon alt tabakayı, yani negatif PDMS alt tabakayı, silikon kalıptan ters çevirerek ve çok yavaşça soyabiliriz. Bunu, bir ucunu sabit tutarak ve PDMS alt tabakayı nazikçe soyarak gerçekleştiriyoruz.

Substrat silikon kalıptan ayrılırken ön kısmın ilerleyişini görebilirsiniz. Silikon kalıbımızın A-P-D-M-S negatif kalıbını oluşturduğumuza göre, nihai ped substratlarını hazırlamak için bunu dört ayrı negatif kalıba bölebiliriz. Yüzeye zarar vermemek için bu aşamada negatif substratın üst kısmına pensle veya eldivenle dokunmamak önemlidir.

Bu noktada, üç mikron çapında ve dokuz mikron derinliğinde kuyucuklardan oluşan silikon ana kalıptan dört adet bireysel negatif kalıp oluşturmuş bulunuyoruz. Yükseltilmiş konsol yüzeylerini yeniden oluşturmak için, PDMS kullanarak bu negatif kalıpların üzerine tekrar PDI PDMS dökebiliriz. Ancak bunu yapmadan önce, bu negatif kalıpları bir floropolimer ile kaplayarak yapışmaz hale getirmek gereklidir.

Bu işlemi, yüz wattlık bir plazma odasında tam güçte bir dakika boyunca gerçekleştiriyoruz. Odada vakumlama işleminin tamamlanmasını bekleyip plazmayı tekrar çalıştırdığımızda, PDMS üst yüzeyini aşındıran ve yüzeyi fluoro Cy Lane molekülleri için daha yapışkan hale getiren bir iyon gaz alanı oluşur. Negatif kalıplar vakum desikatöründen çıkarıldıktan sonra, burada gördüğümüz üzere, yapışkan olmayan bir PDMS tabakası içinde 3 µm x 10 µm derinliğinde kuyucuklardan oluşan bir dizi kalmıştır.

mpad substratları için kullandığımız dikey konsol kirişleri yeniden üretmek amacıyla, aynı PDMS karışımımızı kullanarak bu kalıptan tekrar döküm yapmak gerekir; bu işlem, daha önce hazırladığımız silikon kalıbın birebir aynısını yansıtan, serbest duran elastomerik konsol kiriş dizisi şeklinde pozitif bir yapı sağlayacaktır. Bu prosedürün ilk adımı, yapışkan olmayan negatif kalıplarımızı, PDMS şeritler ve bir cam mikroskop lamından oluşturduğumuz bir montaj düzeneğine aktarmaktır. Bu düzeneğin kullanım nedeni bir sonraki adımda netleşecektir.

Bu aşamada, önceden gazı alınmış olan aynı 10'a 1 oranındaki PDMS ve çapraz bağlayıcı karışımından küçük bir damlayı, her bir negatif kalıbın üst yüzeyine damlatabiliriz. Negatif kalıpların kenarlarına taşmaması için sadece az miktarda PDMS kullanılması yeterlidir. Bu noktada.

PDMS'in kalıpların üst yüzeyine daha geniş bir şekilde yayılmasını sağlamak için, bir kalıbı pens yardımıyla tutup ters çevirebilir ve bitişikteki kalıpla temas ettirerek PDMS'i tüm substratı tamamen kaplayacak şekilde dikkatlice yayabiliriz. Bu adımda, üst PDMS solüsyonuna daha fazla kabarcık girmemesine çok dikkat edilmelidir; ardından aynı işlem diğer iki kuyu, yani diğer iki kalıp için tekrarlanabilir. Üst yüzeyde daha homojen bir PDMS kaplama elde ettiğimize göre, negatif kalıplarımızın üzerindeki PDMS filmine hapsolmuş olabilecek tüm kabarcıkları tamamen gidermek için bu düzeneği bir vakum desikatörüne yerleştirebiliriz.

Bu işlem genellikle yaklaşık 30 dakika sürer. Negatif kalıplarımız gazdan arındırılırken, pedler için nihai montaj alanı olacak 22 by 22 milimetre boyutundaki cam altlıkları temizleyebiliriz. Bu işlemin ilk adımı, sıkıştırılmış nitrojen kullanarak toz partiküllerini üflemekle temizlemektir.

Cam lamelleri gaz plazmasına maruz bırakacağız; bu işlem yüzeyi küllendirecek ve bir sonraki adımda yapıştıracağımız PDMS için yüzeyi daha yapışkan hale getirecektir. PDMS'nin üst katmanının yaklaşık 30 dakika boyunca DGAs'lara maruz kalmasına izin verdikten ve cam lamelleri plazma ile aktive ettikten sonra, şablonumuzu çıkarabilir ve gaz plazmasına maruz kalmış cam lamellerin üst yüzeyini negatif kalıpların üzerindeki PDMS tabakasıyla temas ettirebiliriz. Genellikle, cam lamelin bir kenarını önce PDMS ile temas ettirmek ve ardından cam lamelin geri kalanının yavaşça yerleşmesine izin vermek, PDMS'nin bir tabaka şeklinde yayılmasını sağlamak açısından faydalıdır.

Bu işlem, PDMS filmine giren kabarcıkların azaltılmasına yardımcı olur. Bu noktada, fazla PDMS'i dışarı itmek ve lamel camı şablonun merkezindeki PDMS haçına doğru hizalamak için pensetle lamel camın üst yüzeyine hafifçe bastırabiliriz. Bu uygulama, PDMS kürlenirken lamel camın hareket etmesini önleyecektir.

Bunu diğer substratlar için de tekrarlıyoruz. Bu aşamada, şablonun tamamını fırına aktarabilir ve 110 °C'de 22 saat boyunca pişirebiliriz. Tüm düzeneğin oda sıcaklığına soğumasını bekledikten sonra, substratlarımızı çıkarabilir, ters çevirebilir ve negatif kalıbı lam camından dikkatlice soyabiliriz.

Sütunların ezilmesini veya cam alt tabakadan kopmasını önlemek için bu işlemin yavaşça ve tekdüze bir şekilde yapılması önemlidir. Negatif kalıbı soyduktan sonra, Silikon Master'ı birebir taklit eden bir konsol dizisine sahip olduğumuzu görebiliriz; ancak bunlar artık esnek bir PDMS elastomerinden yapılmıştır. Tamam, böylece bu noktada size Emad alt tabakalarımızın Silikon Master'ını nasıl oluşturduğumuzu göstermiş olduk.

Ardından, konsolların hücrenin yayılmasına, büzülmesine ve bu süreçte konsolları saptırmasına olanak tanıyacak şekilde esnek olması için A-P-D-M-S elastomerik polimer kullanarak birebir bir kopya oluşturmak amacıyla bir replika kalıplama işlemi uyguladık. Bu noktada, substratlarımız hücre kültürü işlemleri için hazırdır. EDS'leri üretmek için kalıpların nasıl fabrikalandığını ve kopyalandığını gördüğümüze göre, hücre kültürü yapabilmemiz ve ardından traksiyon kuvvetlerini analiz edebilmemiz için EDS'leri fonksiyonel hale getirmek amacıyla birkaç adım daha uygulayacağız.

Ancak bunu yapmadan önce üç şey yapmamız gerekiyor. Öncelikle, sütunların uçlarını hücreler için yapışkan hale getirmeliyiz. İkinci olarak, sütun sapmalarının görselleştirilmesine ve analizine yardımcı olmak için PDMS'i floresanla işaretlemeliyiz.

Üçüncü olarak, traksiyon kuvvetlerinin yalnızca direk uçlarında uygulanması için direklerin yan duvarlarını ve tabanlarını hücreler için yapışmaz hale getirmemiz gerekiyor. Takip eden dakikalarda, bu adımların mikro temas baskılama tabanlı strateji ile nasıl gerçekleştirildiğini göreceğiz. Ancak öncelikle, bir sonraki adım, fazla PDMS'in yüzeyden temizlenmesidir.

Belirttiğim gibi, ilk adım, West'in nasıl oluşturulacağını ve nasıl kırpılacağını az önce gösterdiği EDS alt tabakasını almaktır. Cam kapatma lamini negatif kalıba karşı kürleyerek ortaya çıkan fazla PDMS'i keskin bir jiletle kırpın. Fazla PDMS'i, jileti sütunların kenarındaki alt tabakaya dikey olarak yerleştirip ardından kazıyarak temizlersiniz.

Lamelin yerinden oynamamasını sağlamak için bir parmağınızla lameli sabit tutabilirsiniz. Böylece elde ettiğimiz şey, kalıntılardan temizlenmiş ve bu sayede kolayca erişilebilir hale gelmiş bir MPA altlığıdır. Bir sonraki adımda, postların uçlarını yapışkan hale getirmek için MPA'lara mikro temas baskı uygulamamız gerekiyor.

Bunu yapmak için öncelikle damgalar oluşturmamız gerekir ve bu işlem oldukça kolaydır. PDMS'yi 10:1 oranı yerine 30:1 oranında karıştırırız. PDMS yüksekliği yaklaşık 1 cm olacak şekilde bir Petri kabına dökeriz.

Gazının çıkmasını bekleyin. Yani baloncukların PDMS'in üst kısmına yükselmesine izin verin ve çapraz bağlanma reaksiyonunu fırında 60 °C'de bir saat boyunca kürleyin; kabı fırından çıkarıp soğumasını bekledikten sonra artık damgaları kesmeye hazırım. Bu nedenle, yine aynı türde bir jilet kullanarak, Petri kabının tabanına temas edene kadar PDMS'e dikey olarak aşağı doğru bastırarak kesin.

Şimdi, damganın yönüne dikkat etmemiz gerekiyor. Damga yüzeyi, düz kalması için Petri kabının tabanına karşı dökülen PDMS tarafı olacaktır. Dolayısıyla, kesmiş olduğum bu büyük PDMS karesinde, damga yüzeyi şu an yukarı bakmaktadır.

Şu an bu damga M pedlerinden çok daha büyük, bu yüzden jiletle keserek onu tekrar tek bir M pedi boyutuna getireceğim; damganın doğru yönünü gözle belirlemek çok zor olduğu için, damganın arka tarafı olacak olan yüzey dışı kısmına tam olarak şöyle küçük bir çentik atacağım. Ardından damgayı daha büyük olan plakadan çıkarabilirim. Böylece bir sonraki adım için elimde bir A-P-D-M-S damgası olmuş oldu.

PDMS damgaları temizlemek istiyoruz. Damgaları keserken atmosferdeki tozların PDMS damgalarının üzerine çökmüş olması oldukça muhtemeldir. Bu işlemde, istenilen sayıdaki PDMS damgasını bu kristalizasyon kabına yerleştiriyoruz ve kristalizasyon kabını %100 etanol ile dolduruyoruz.

Damgaların yüzeyini kaplayacak kadar etanol ekleyin; ancak eklenen etanolün kesin miktarı önemli değildir. Ardından kristalleştirme diskini bir tutucuya yerleştirin ve damgaları beş dakika boyunca sonike edin. Beş dakika dolduğunda, damgaların sterilizasyon işlemini tamamlayacağız ve mikro temas baskı yönteminin geri kalan kısmı olan M pedlerinin fonksiyonelleştirme işlemini steril bir doku kültürü önlemi altında gerçekleştireceğiz.

Şimdi, damgaların sterilizasyon işlemini tamamlayabileceğimiz doku kültürü kabinindeyiz. Bunu yapmak için, damgaları kristalleşme kabından alır, kalan tüm kalıntıları durulamak için etanol dolu bir kaba daldırır ve son olarak etanolü durulamak için bir su kabına daldırırız. Ardından, görünür damlacık kalmayana kadar damgaları bir nitrojen akımı ile kuruturuz.

Bir sonraki adımda, damgaları bir protein çözeltisi ile mürekkeplememiz gerekiyor. Kullandığımız protein çözeltisi, DEI su içinde 50 µg/mL fibrin'dir. Pipetle protein çözeltisinden bir miktar alın ve protein çözeltisi damlalarını damga yüzeyine yerleştirin.

Bunu, damga yüzeyinin kenarlarına küçük damlacıklar yerleştirerek yapmanız gerekir. Öncelikle, bunu kullanacağınız tüm damgalar için tekrarlayın; bunu önceden yapmış olmam gerekirdi. Tüm damgaların kenarlarına noktalar yerleştirdikten sonraki sonraki adım, bu damlacıkları birleştirmek ve damga yüzeyini protein çözeltisiyle doldurmaktır.

Bunu yapmamızın nedeni, damlacıklardaki protein çözeltisinin damlacıkların altına sızarak damga yüzeyini hidrofilik hale getirmesi ve böylece hücre dışı matris proteininin yayılmasını kolaylaştırmasıdır. Bu işlemi kullandığınız tüm damgalar için tekrarlayın. Protein çözeltisini damgaların yüzeyine yaydıktan sonra, damgaları mürekkepleme işleminin son adımı kenarların kaplandığından emin olmaktır. Bunu yapmak için, bir pipeti açılı tutarak damga yüzeyi boyunca hareket ettirin; böylece hem PDMS damganın köşesiyle hem de protein çözeltisiyle temas sağlamış olursunuz.

Ve aynı işlemi, mürekkeplediğiniz tüm damgaların tüm kenarları için tekrarlayın. Damgaların mürekkepleme işlemini tamamladıktan sonra, proteinin damga yüzeyine tamamen emilmesini kolaylaştırmak için damgaları doku kültürü kabininde bir saat boyunca bekletiyoruz. Proteinlerin damga yüzeyine emilmesi için bir saat beklediğimize göre, şimdi onları suyla durulama ve azotla kurutma zamanı.

Bunu yapmak için steril su alırız ve steril suyu damgaları içeren kaba boşaltırız. Suyu doğrudan damga yüzeyine dökmemeye dikkat edin; gerekirse bir pipet kullanabilirsiniz. Su seviyesini protein çözeltisinin üzerine çıkardığınız sürece, kullandığınız suyun tam miktarı önemli değildir.

Bundan sonra, steril pens ile bir damga alın, bunu yeni bir su kabına batırın ve nitrojen ile nazikçe üfleyerek kurutun. Damga üzerinde protein çözeltisi damlacıkları görülmediğinde kuruduğunu anlamış olacaksınız. Bu işlemi, tek tek işlediğiniz tüm damgalar için tekrarlayın.

Damgaları durulayıp kuruladığımıza göre, mpad substratlarını UV ozon ile işlem yaparak aktive etme zamanı geldi. Yedi dakika boyunca, Petri kabının kapağını üstten çıkarıyorum. Polistiren UV emici olduğu için kabı UV ozon cihazına yerleştiriyorum, çekmeceyi kapatıyorum, süreyi yedi dakikaya ayarlıyorum ve işlemi başlatıyorum.

Şimdi tekrar doku kültürü kabinine döndük ve UV ozonla yeni işleme tabi tutulmuş mpad altlıklarını damgalama zamanı geldi. Bunu yapmak için, durulanmış ve kurutulmuş damgaları pensle kaldırın. Damgaları yanlarından tutabilirsiniz ancak damganın yüzeyine dokunmayın.

Protein tarafı erişilebilir olacak şekilde pensle tutulan damgayı ayarlamanız gerekir. Ardından, protein tarafının aşağıya baktığını unutmadan pensi ters çevirin ve damgayı yavaşça eds ile temas ettirin. Bir ila 30 arasındaki damgalar oldukça yapışkan olduğundan, damgayı pensten ayırmak için ikinci bir cımbız kullanmanız gerekebilir.

Damgayı, emedlerin üzerine yaklaşık iki milimetre ile sekiz milimetre arasındaki bir yükseklikten bırakabilirsiniz. Ardından, damga ile ed'ler arasında temas oluşturmak için emedlerin bulunduğu kabı yukarı doğru eğin ve pensle hafifçe bastırın. Temasın gerçekleştiğini iki yoldan biriyle anlayacaksınız.

Birincisi, ED yüzeyine damganın yan tarafından bakmaktır. Bunu kamera üzerinden görmek zor olabilir, ancak damganın yanından yüzeye baktığımda, damganın yüzeyle temas ettiğini gözle net bir şekilde görebiliyorum. Teması sağlamanın ikinci yolu ise, Petri kabını kapağı kapalıyken doku kültürü davlumbazından çıkarmak ve bir invert mikroskop altında incelemektir.

Mikroskop ile girişim desenlerini görselleştirerek, damganın eds ile ne zaman, eğer gerçekleşmişse hangi anda temas ettiğini belirleyebilmeniz gerekir. Temas gerçekleştiğinde, damganın ed substratı ile yalnızca birkaç saniye boyunca temas halinde kalması yeterlidir. Artık damgayı kaldırma zamanı gelmiştir.

Bunu yapmak için, bir cımbız yardımıyla uçları aşağı doğru katlayın ve tek bir pürüzsüz hareketle damgayı soyun. Hangi uçları damgaladığınızı ve hangi damgaları daha önce kullandığınızı takip ettiğinizden emin olun. Bu prosedürü, kullanmak istediğiniz her substrat için her bir EMPA başına bir kez tekrarlayın.

EMPAs damgalandıktan sonraki adım, onları sterilize etmek ve ardından "dye eye" adı verilen lipofilik bir boyada inkübe etmektir. Dye eye, floresan etikete sahip lipofilik bir moleküldür; bu sayede belirli bir süre boyunca PDMS'e difüze olur ve mikroskop altında post defleksiyonlarını görselleştirmemize olanak tanır. Şimdi yapacağım işlem, her bir EMPA substratını tek tek alarak sırasıyla %100 etanol, %70 etanol, DI su, DI su, DI su, DI su içerisine daldırmaktır.

Ve son olarak, 5 µg/ml konsantrasyonunda bir DiI çözeltisi. DiI çözeltisi floresan özelliktedir, bu nedenle ortam ışığına maruz kalmasını ve fotobeyazlamasını en aza indirmek için, doku kültürü davulunda bir saat boyunca inkübe edilirken kapları alüminyum folyo ile kapatıyoruz. EM pedlerinin DiI çözeltisi içinde inkübe edilmesi için bir saat beklediğimize göre, artık alüminyum folyoyu kaldırabilir ve DiI çözeltisini durulayabiliriz.

Sterilize edilmiş su içerisinde art arda üç kez daldırma işlemi yaparak durulama sağlıyoruz ve son olarak, %0,2'lik onic F1 27 çözeltisine daldırıyoruz. Bu oran ağırlık/hacim cinsinden %0,2'dir. Tüm daldırma aşamaları boyunca, EM pedlerinin havaya maruz kaldığı süreyi minimumda tutmak önemlidir. Bu işlem, ED substratlarının zarar görmesini ve özellikle iki direğin birbirinin üzerine çökmesini önlemek içindir.

%0,2'lik F1 27, hidrofilik ve hidrofobik bölgelerden oluşan bir triblok kopolimerdir. Hidrofilik bölgenin protein absorbsiyonuna ve dolayısıyla hücre yapışmasına karşı direnç gösterdiği bilinirken, hidrofobik bölge ise hidrofobik PDMS'ye bağlanır. Bu nedenle, PDMS F1 27 içinde bekletildiğinde, F1 27 PDMS'ye bağlanır ve hücre yapışmasını engeller.

Alüminyum folyo ile kapatılmış bir Petri kabında, kronik F1 27 içerisinde bir saatlik inkübasyonun ardından, F1 27'yi sırasıyla steril su, steril su ve PBS içindeki daldırmalarla durulayabiliriz. PBS içindeki daldırma işlemi yapılıp F1 27 ürünü durulandıktan sonra, substratları seçilen hücre kültürü çözeltisine daldırabiliriz. EMPA'ları daldırdığım bu hücre kültürü çözeltisi; serum ve/veya diğer büyüme faktörlerini ve/veya penisilin ve streptomisin gibi takviyeleri içerebilir.

Tüm bu bileşenler EMPA tedavileriyle tamamen uyumludur. Şimdi bir sonraki adım, ed'ler hücre kültürü solüsyonuna daldırıldıktan sonra, seçilen hücrelerin ed'lerin üzerine ekilmesidir. Bu özel deney düzeneği için, üç farklı kaba bovine pulmoner aortik endotel hücreleri ekeceğim.

Üç farklı kap kullanmamın nedeni, daha sonra analiz edebilmek için kaplardan ikisini, direklerin sapmalarını engellemek amacıyla bilinen dokunsallık inhibitörleri ile işleme tabi tutacak olmamdır. Hücre ekimi için hücre süspansiyonumu alıyorum, pipete uygun miktarda çekiyorum ve her bir kaba damla damla ekliyorum. Traksiyon kuvvetlerini ölçmek için analiz yaptığımda, hücrelerin yüzeyde tekil hücreler şeklinde bulunması için yeterli miktarda hücre ekliyorum.

Ekleyeceğiniz miktar, yayılma alanının yanı sıra kullandığınız hücrelerin büyüme hızına bağlıdır. Genellikle substratın santimetrekare başına 1500 ile 5.000 arasında hücre ekimi yaparız. Hücre ekimini tamamladıktan veya hücre süspansiyonunu düzenledikten sonra, hücre süspansiyonunu kültür kabı içinde karıştırmak için kültürü dik yönlerde birkaç kez hafifçe ileri geri sallayın.

Bu işlemi kullandığınız tüm substratlar için tekrarlayın. Hücreleri ekdikten hemen sonra, pH'ı ve hücre kültürü ortamını tamponlamak için uygun karbondioksit seviyesine sahip 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Hücreleri ekimden yaklaşık iki saat sonra, substratları bir ortam kabından aynı hücre kültürü ortamının bulunduğu taze bir kaba aktararak hücreleri durulamak uygundur.

Bu durulamanın nedeni, çoğu hücrenin iki saat içinde yayılmaya başlamış olması ve neredeyse nihai yayılma alanlarına ulaşmış olacak olmasıdır. Hücreleri ve substratları durulayarak, hücre kültürü ortamındaki yüzer hücreleri uzaklaştırmış olursunuz. Böylece, sadece EDS'ye tutunmuş ve yayılma sürecine başlamış olan hücreler, traksiyon kuvvetleri için yapılan son nokta analizinde görünecektir.

MPA'lar üzerinde kültüre edilmiş hücrelerle gerçekleştirebileceğimiz bir analiz, hücresel kontraktilite dinamiklerini nicel olarak incelemek için zaman geçirmeli görüntülemedir. Özellikle, çözünür faktörlere yanıt olarak gelişen hücresel kontraktilite dinamikleri ilgi çekicidir. Biyolojik bileşikler ve sentetik bileşikler gibi çözünür faktörlerin hücresel kontraktiliteyi artırdığı, azalttığı veya bilinmeyen etkiler yarattığı bilinmektedir.

Bu canlı hücre deneyi için, bu ters epi floresan mikroskobunu kullanacağız. Mikroskop tablasında, sıcaklığı 37 °C'de ve %5 CO2 seviyesinde tutmak için bir termal regülatöre bağlanmış küçük bir inkubatör kutusu bulunmaktadır. Görüntüleme işlemini 60 x plan APO objektif ile yüksek büyütmede gerçekleştireceğiz.

Şimdi görüntüleme için etki substratını hazırlayacağız. Görüntüleme için kullandığımız 60x objektifin 200 mikronluk bir çalışma mesafesi vardır ve bu mesafe, hücreleri daha önce ektiğimiz doku kültürü kabının kalınlığından çok daha azdır. Bu nedenle, doku kültürü kabındaki implantlar üzerindeki hücreleri görüntüleyemeyiz.

Bu sorunu aşmak için bu cam tabanlı kapları kullanıyoruz. Şimdi substratı, hücreler ve sütunların uçları cam tabanlı kabın ara yüzeyinde olacak şekilde, ters bir şekilde cam tabanlı kaba aktaracağım. Böylece, bu düzenek mikroskopa yerleştirildiğinde, hücreler ile objektif arasındaki çalışma mesafesi 200 mikronun altında olacaktır.

Şimdi bunu görüntüleme için mikroskoba yerleştirmeye hazırız. Şimdi canlı hücre inkübatör haznesini açacağım, örneği içeriye yerleştireceğim ve inkübatör haznesinin kapağını tekrar kapatacağım. Bu noktada, uygun bir hücre bulmak için substratı tarayacağım.

Görüntülemek için. Bunu yapmanın en verimli yolu, substratın daha geniş bir alanını görmemi ve hücreyi daha hızlı bulmamı sağlayacak olan 10x faz kontrast objektifi kullanmaktır. İyi bir hücre için kriterim, tek bir hücre olmasıdır.

Herhangi bir komşu hücreye temas etmemeli ve ayrıca substrattaki diğer tüm hücrelerle karşılaştırıldığında boyutu ortalama düzeyde olmalıdır; incelemek için uygun bir hücre buldum. Bir sonraki adımda, hücreye yüksek büyütme ile bakmak için objektifi 60 x ile değiştireceğim. Bunu yapmak için, rotasyon sırasında tablasına çarpmaması adına objektifi odağı dışında tutuyoruz.

Taret döndürülürken hazne açılır, 60x objektif kısmen döndürülür; 60x objektif bir yağ daldırma lensidir, bu nedenle objektif lensinin üzerine bir damla daldırma yağı yerleştirmemiz gerekir. Şimdi, 60x lensini konumuna getirmek için tareti döndürmeyi tamamlayacağız. İnkübatör haznesini kapatıp hücreyi tekrar odağa getirmek için objektifi yeniden odaklayacağız.

Hücrenin konumunu ve odağını hassas bir şekilde ayarladıktan sonra, hücreyi bilgisayar ekranında önizlemek için CCD kameraya geçeceğim ve ardından zaman ayarlı görüntülemeyi başlatacağım. Bu deneyde, hem faz kontrast hem de floresan görüntüleri birer dakika aralıklarla toplayacağım; böylece zaman ayarlı görüntüleme başlamış oldu. Görüntülemeyi 10 dakika veya 10 kare boyunca çalıştıracağım ve bu noktada serum ekleyeceğim. 10 dakika geçti. Şimdi hazneyi açacağım ve hücrede kontraksiyonu uyarmak için kaba serum ekleyeceğim.

Zamanlayıcı hâlâ çalışıyor, bu yüzden bunu hızlıca yapmam gerekiyor. Şimdi, kontraktilitedeki herhangi bir değişikliği takip etmek için hücreyi 30 dakika boyunca görüntülemeye devam edeceğiz. Time-lapse görüntüleme işlemini tamamladıktan sonra, görüntüler gösterilen videodaki gibi sıralanabilir. İşte faz ve floresan görüntülerinden oluşan iki video.

Solda, siyahla çevrelenmiş, çoğunlukla şeffaf bir hücrenin faz kontrastlı filmi yer almaktadır. Hücre, dikdörtgen bir kafes şeklinde düzenlenmiş dairesel yapılar olan 20 postun uçlarına yayılmıştır. Sağda ise aynı hücrenin floresan filmi bulunmaktadır, ancak burada yalnızca postlar görünür durumdadır.

Bu videoları oynattığımda, hücreye bağlı olan direklerin başlangıçta zayıf olduğunu, saptığını ve dikdörtgen örgüden çok az uzaklaştığını göreceksiniz. Videonun ortalarına doğru, ortama serum ekledim. Serum, hücreyi kontraktilitesini artırmaya teşvik eder.

Hücre, altındaki sütunlar üzerinde daha büyük traksiyon kuvvetleri uyguladıkça, hücrenin çevresi boyunca yer alan sütunlar içe doğru sapmaya başlar. Floresan videoda, sütunların dikdörtgen kafesteki konumlarından önemli ölçüde saptığını görüyorsunuz. Daha sonra açıklayacağım üzere, bu görüntülerdeki sütun konumlarının yer değiştirmesi, bu hücrenin traksiyon kuvvetlerini analiz etmek için kullanılabilir.

Daha önce, mpad substratlarını nasıl oluşturduğumuzu ve hücre kültürü yapabilmek için bunları nasıl fonksiyonelleştirdiğimizi gördük. Şimdi fark etmiş olacağınız üzere, tamamlanmış mpad substratlarını üç farklı hücre kültürü kabına yerleştirdim. Hücreler gece boyunca büyüdü ve şimdi yapacağım şey, her bir hücre kültürü kabını, kontraktiliteyi bilinen bir şekilde modüle eden farklı bir çözünür ajanla işleme tabi tutmaktır.

Ardından, hücreleri 30 dakika sonra sabitledikten sonra ortaya çıkan traksiyon kuvvetlerini kantitatif bir şekilde ölçebiliriz. Kontraktilite inhibitörleri eklendikten 30 dakika sonra çözünür faktörler eklendiğinde, mevcut traksiyon kuvvetleri durumunu kilitlemek için hücreleri paraformaldehit ile sabitleme zamanı gelmiştir. Bunu yapmak için, kalsiyum ve magnezyum içeren paraformaldehit kullanmak önemlidir ve %3,7 hacim yüzdesinde paraformaldehit kullanıyoruz. Substratların paraformaldehite daldırma yöntemi, fonksiyonelleştirme sırasındaki farklı RIN'lere daldırma yöntemi ile aynıdır.

Yani, substratların kurumasını engellemek önemlidir çünkü bu durum çökme sonrası bozulmalara yol açabilir. Substratları aktardıktan sonra, onları 20 dakika boyunca paraformaldehit içinde inkübe ediyorum. 20 dakika dolduğunda, substratları paraformaldehitten çıkarıyoruz ve hücreler fikse edildiğine göre artık bu örnekleri standart immün boyama için işleyebiliriz.

Bunu yapmak için, substratları param üzerine yüzleri yukarı bakacak şekilde yerleştiriyoruz ve substratı örtecek ve PBS altında tutacak kadar PBS pipetliyoruz. Daha sonra, kültürde kalmış olabilecek paraformaldehiti uzaklaştırmak için substratı üç kez PBS ile duruluyoruz. Substratı üç kez PBS ile duruladıktan sonra, substratı sonraki immün boyama işlemleri için transfer edebiliriz.

Bunu, substratı bir cımbız yardımıyla tutarak ve immün boyamanın ilk adımı olan permeabilizasyon ajanı aşamasında ters çevirerek gerçekleştiriyoruz. Bu durumda, PBS içinde %0.2 Triton X kullanıyoruz. Bununla birlikte, kullanıcı ihtiyaçlarına en uygun olan herhangi bir permeabilizasyon ajanını kullanabilir.

Bu işlemi tüm substratlarımız için tekrarlıyoruz; immün boyama işlemi sırasında substratları bu şekilde yönetiyoruz. İmmün boyamanın ardından substratlar, ters veya düz fark etmeksizin herhangi bir epi floresan mikroskobunda işlenebilen standart bir inç çarpı üç inçlik cam lam üzerine monte edilir. Örnekleri konfokal mikroskopta işleyerek, sapma olmamış yani sıfır konumlarını elde etmek için sütunların tabanına odaklanabiliriz.

Ardından, odak noktasını direklerin uçlarına getirip direklerin başka bir görüntüsünü alabilir ve üstteki görüntü ile alttaki görüntüyü karşılaştırarak, direklerdeki sapmaları ölçebilir ve hücrelerin bu sapmaları oluşturmak için ürettiği traksiyon kuvvetlerini hesaplayabiliriz. Bu işlemi birçok farklı hücre ve çeşitli farklı koşullar için tekrarlayarak, farklı koşullarda üretilen traksiyon kuvvetlerini karşılaştırabiliriz. Hem canlı hem de fikse edilmiş hücrelerin görüntülerini topladığımıza göre, bir sonraki görevimiz sapmayı ölçmek ve hücrelerdeki traksiyon kuvvetlerini belirlemektir.

Bunu yapmak için matlab dilinde bir bilgisayar programı yazdık. Bunlar, bu analizde kullanacağımız üç görüntüdür. İlk görüntü, hücrenin faz görüntüsüdür.

Hücrenin konumunu belirlemek için faydalıdır. İkinci görüntü, desteklerin uçlarının floresan görüntüsüdür. Bu görüntüyü, desteklerin uçlarındaki konumlarını belirlemek için kullanırız.

Gördüğünüz gibi, bu direklerin bazıları saptamış durumdadır ve çoğu direğin bulunduğu dikdörtgen örgüden, örneğin şu direk ve bu direk gibi, sapma göstermektedir. Kullanacağımız üçüncü görüntü, direklerin tabanlarından geçen bir odak düzlemindeki konumlarını yakalayan taban görüntüsüdür.

Bu aşamada, hem eğilmiş hem de eğilmemiş direkler dinlenme konumlarında, yani eğilmemiş pozisyonlarında olmalıdır. Dikdörtgen kafeste, ikinci görüntüde tabanlarından eğilmiş olan direklerin şu anki konumlarında olduklarını görebilirsiniz. Bu görüntü, direğin eğilmemiş konumunun belirlenmesi için kullanılır.

Ardından, bizden bu üç görüntüyü yüklememizi isteyen MATLAB programını yüklüyoruz. Dosyaya bir isim verin. Faz görüntüsünü görüyorsunuz.

Programın hangi sütunları analiz edeceğini bilmesi için hücrenin bulunduğu yeri belirten bir kutucuk çizeceğiz. Program daha sonra, sütunların OID koordinatlarını belirlemek için kırpılmış görüntünün yoğunluklandırmasını, eşikleme ve normalizasyon işlemlerini gerçekleştirir. Solda, üst görüntüdeki sütunların normalize edilmiş görüntüleri, sağda ise taban görüntüsündeki aynı sütunların normalize edilmiş görüntüleri yer almaktadır.

Sütunlar ve OID koordinatları elde edildikten sonra program, her bir sütunun ucu ile tabanı arasındaki yer değiştirme vektörlerini belirleyebilir. Bu sütun yer değiştirme vektörleri, sütunun yay sabiti ile çarpılarak kuvvet vektörlerine dönüştürülebilir. Bu hücresel kuvvetları, hücre başına ortalama kuvvet veya sütun başına ortalama kuvvet gibi çeşitli yöntemlerle analiz edebiliriz.

Faydalı sonuçlardan biri, kuvvetlerin mekansal dağılımını görselleştirmemizi sağlayan bir ok diyagramıdır (quiver plot). Bu, az önce analiz ettiğimiz hücredir ve kuvvetin büyüklüğüyle ilişkilendirilmiş ve kuvvetin yönünü gösteren sarı okları direklerin üzerine yerleştirdiğimi görebilirsiniz. Bu görüntü analiz sürecini, zaman ayarlı filmimizde gerekenler gibi ardışık görüntüler için tekrarlayarak, zamansal bir dizi oluşturabiliriz.

İşte serumla uyardığımız hücrenin bir videosu. Gördüğünüz üzere, serum eklendiği anda hücrenin kontraktilitesi artmış ve sütunları daha da fazla saptırmıştır. Ayrıca, farklı koşullara tabi tutulmuş ve ardından fiksasyon ve boyama işlemleri uygulanmış daha fazla sayıda hücreye ait kuvvetleri nicelleştirebiliriz; bu durum, kontrol bileşiği ile işlem görmüş bir hücreye karşı kontraktilite inhibitörleri ile işlem görmüş hücreleri gösteren bu quiver grafikleriyle örneklendirilmiştir.

Görebileceğiniz üzere, kontrol durumundaki hücre üzerindeki kuvvet vektörleri, kontraktilite inhibitörlerinin kullanıldığı iki durumdaki kuvvet vektörlerinden daha uzunlukta ve büyüklüktedir. Bu substratların çok yönlülüğünü göstermek için mikro fabrikasyondan örnek hazırlamaya, deneyden analize kadar olan tüm süreci burada detaylandırdık.

Canlı hücre görüntüleme ve sabitlenmiş örnek analizi olmak üzere iki farklı analiz yöntemini tanımladık; her iki yöntemden elde edilen hücrelerin analizlerini yaparak quiver grafikleri ve videoları sunduk. Bu güçlü araçla, hücre kontraktilitesinin çeşitli mekansal ve zamansal analizleri gerçekleştirilebilir. Gördüğünüz üzere bu yöntem; mikro fabrikasyon, temel hücre biyolojisi, yüzey bilimi, görüntü analizi ve işlemesi gibi pek çok farklı disiplinden faydalanmaktadır.

Yönteminin birkaç farklı mühendislik tekniğine dayanması sayesinde, post geometrisi, indüklenen çözünür faktörler ve post sapmalarını analiz etme yöntemleri gibi parametreler kullanıcının ihtiyaçlarına göre özelleştirilebilmektedir. Geçtiğimiz 20-30 dakika boyunca ana hatlarını belirttiğimiz bu yöntemin görsel gösteriminin; hücresel çekim kuvvetlerinin düzenlenmesi, fonksiyonel sonuçları ve oluşumu üzerine yapılacak diğer ve daha derin analizler için bir başlangıç noktası olarak kullanılmasına yönelik temennimizdir.